在TSA多色荧光的世界里，我们追求的是在同一张切片上描绘出绚丽的生物学图谱。然而，与可逆的传统荧光染色不同，TSA的每一步都像是“泼出去的墨”——每种荧光染料都会通过共价键与样本牢牢结合，一旦某个靶点标记失败，整个实验便无法回头，导致前功尽弃。

正因如此，在实验开始前，科学地设置染色顺序是成功与否的决定因素。普拉特泽生物专业承接TSA技术服务外包、蛋白原核表达服务等实验代做服务，积累专业丰富的实验操作经验，我们就来深入探讨这份决定TSA多色实验命运的“顺序攻略”。

一、 抗体必须逐个验证

核心原则： 在完全熟悉每个靶点及对应抗体的染色效果、最佳条件之前，绝对不要贸然进行多色标记。

行动指南：从单色开始：为每个抗体独立进行TSA单标实验，从DAB优化再到荧光确认。

建立档案：记录下每款抗体理想的一抗浓度、二抗孵育时间、TSA显色时间，以及最重要的——它所能耐受的抗原修复强度和后续灭活处理的次数。

意义：这一步是后续所有排序设计的基础数据，能有效避免因某个抗体“掉链子”而毁掉整个珍贵样本的悲剧。

二、 靶点顺序

确定了每个抗体的特性后，我们就要为它们安排出场顺序。

1. 按抗原修复敏感性排序

先锋：不能长时间修复的抗原（如某些磷酸化位点、不稳定的表位），必须安排在第一轮。因为它们经受不住后续轮次的剧烈热修复。

后卫：需长时间或高强度修复才能暴露表位的抗原，则可以安心安排在最后一轮。

2. 遵循“先低后高”、“先少后多”原则

先低后高：优先标记表达量低、难检测的靶点。因为早期的染色轮次对抗原的破坏最小，能为其保留最高的抗原性和最佳的信噪比。

先少后多：优先标记在组织内分布范围小、阳性细胞少的靶点。这样能避免后期强信号或广泛信号对稀少信号造成的遮盖。

3. 考虑抗体的“顽固”程度

如果已知某个一抗/二抗复合物在后续处理中难以被彻底去除或灭活，容易产生交叉反应，那么最安全的方法就是将它安排在最后一轮，从根本上杜绝干扰。

三、 荧光顺序

荧光通道的选择顺序，需要根据您的工作模式来决定。

场景一：工业用户/大批量“盲染”
对于需要高通量、流程化操作的用户，可能无法在每轮染色后都镜下观察。

策略：遵循平衡原则。不再纠结于哪个通道先染，而是将不同样本的通道顺序进行平衡设计。例如，在一项大规模研究中，将一半样本的A靶点用Cy3标记，另一半用Cy5标记，最后合并数据分析。这样做可以消除因荧光通道顺序引入的系统误差，保证结果的客观性和可重复性。

场景二：科研用户/可逐轮观察
对于科研用户，边染边观察是值得鼓励的黄金流程。

通道间无顺序：先染Cy3还是先染Cy5，没有绝对规定，可根据靶点顺序灵活调整。

通道内有讲究：在同一通道内（例如都使用Cy3），如果需标记两个不同物种来源的靶点，建议先染低丰度靶点，后染高丰度靶点，以确保弱信号不被掩盖。

波长策略：在可能的情况下，尽量先染短波长荧光（如FITC），后染长波长荧光（如Cy5）。因为长波长荧光的光子能量低，对已沉积的短波长荧光信号光漂白影响更小，有助于所有信号的整体稳定性。

总结

TSA多色荧光的每个抗体都必须经过单标验证，靶点顺序遵循修复敏感性、“先低后高” 的核心逻辑。根据工作模式选择“盲染”的平衡策略或“边染边看”的优化策略。掌握这份“顺序攻略”，您将能极大地提高TSA多色荧光的一次成功率。噗啦噗啦实验室TSA试剂盒（RK50025）具有强大的信号放大能力、优异的稳定性和出色的背景控制，可以助您科研一臂之力。