在免疫荧光里，TSA酪胺信号放大技术因其超高灵敏度而备受青睐，尤其适用于检测组织中低丰度的靶点蛋白。然而，与传统的免疫荧光法不同，TSA技术涉及多轮顺序的抗体孵育、HRP催化和化学灭活，流程更为复杂。正所谓“工欲善其事，必先利其器”。在TSA多色实验中，能否成功获得清晰、特异、无交叉的多色图像，关键在于实验开始前的抗体选择与验证策略。普拉特泽生物专业承接TSA技术服务外包、蛋白原核表达服务、ko技术服务等实验代做服务，积累专业丰富的实验操作经验，今天为大家详细分享相关知识。

一、 一抗选择：奠定成功的基石

一抗是特异性识别靶点的“先锋部队”，其质量直接决定了实验的特异性。

1. 源头把关：优选经过实践检验的抗体

临床病理诊断常用抗体：这些抗体通常经过大量临床样本的验证，特异性与可靠性有保障，是首选的“放心抗体”。

文献报道中的抗体：关注高水平文献中反复使用的抗体克隆号，这是最直接的参考，能帮助您绕过许多前人踩过的“坑”。

2. 类型与种属：单克隆为上，种属匹配要小心

优先选择单克隆抗体：单抗只识别抗原的某一个表位，特异性远高于多抗，能有效减少非特异性背景。对于多抗，务必谨慎选择。

注意样本与一抗的种属：这是一个经典但易错的问题。对于小鼠组织的样本，尽量避免使用小鼠来源的一抗，以免内源性IgG导致高背景。当然，在细胞染色中，通过特殊的阻断剂可以解决此问题，但对组织样本而言，直接换用兔、大鼠等来源的一抗是更稳妥的方案。

3. 针对性选择：石蜡样本的“黄金标准”

对于福尔马林固定石蜡包埋样本，强烈推荐选择厂家明确标注 “IHC-P” 应用的抗体。

其中，“KO-VALIDATED” 是特异性验证的“王牌”。这意味着该抗体在基因敲除的样本中无信号，而在野生型样本中有信号，从实验上完美证明了其特异性，堪称石蜡样本IHC的黄金标准。

二、 二抗选择：构筑高效特异的信号桥梁

二抗负责连接一抗与TSA信号放大系统，其“干净”与“高效”至关重要。

1. 极致纯净：务必选择“预吸附”二抗

多色实验中，我们使用来自不同物种的一抗。为了确保抗兔二抗不会与您的小鼠或大鼠一抗发生交叉反应，必须使用经过预吸附（交叉吸附） 处理的二抗。它能极大降低由物种交叉反应导致的非特异性背景，对于免疫细胞密集、背景易脏的样本尤其关键。

2. 效率与信号：HRP直接标记与多聚体技术

HRP直接标记二抗：相较于传统的“一抗→无酶二抗→HRP三抗”间接法，使用HRP直接标记的二抗可以简化一步流程，缩短时间，同时减少非特异性结合，是TSA实验的更优选择。

HRP多聚体二抗：该技术将多个HRP酶集合在一个聚合物上，再与二抗偶联。当它与一抗结合时，相当于在同一个位点“部署”了多个HRP，能显著增强后续的TSA信号，获得更高的信噪比，对于弱表达靶点的检测尤为有利。

三、 抗体特异性验证：专业知识的终极体现

在将抗体正式投入宝贵的TSA多色实验前，充分的验证是避免“翻车”的必要步骤。

1. 从简到繁：建议从DAB显色的IHC开始

在开展复杂的多色荧光前，强烈建议先用传统的DAB显色进行单靶点免疫组化优化。DAB显色结果稳定，且能在普通光学显微镜下观察，便于快速优化一抗浓度、孵育条件、抗原修复方案等，成本也更低。

2. 综合判读：依靠专业知识判断定位

抗体的特异性最终体现在其信号是否符合预期。这需要研究者具备扎实的专业知识，综合判断信号是否位于正确的组织区域、细胞类型，以及是否为预期的亚细胞定位。一个声称是膜蛋白的抗体，如果信号全部弥漫在胞浆，那么它的特异性就值得怀疑。

3. 详尽记录：建立自己的“抗体护照”

在验证过程中，请务必详细记录下每个靶点获得最佳信噪比的所有关键参数：一抗的工作浓度、孵育时间和温度；二抗的孵育时间；以及TSA的显色时间。这份宝贵的记录将成为您后续进行可重复的多色实验的“标准操作程序”。

总结

TSA多色荧光是一项强大的技术，但成功运用TSA技术需要：精心挑选的、经过验证的高特异性一抗；高效且“洁净” 的HRP标记二抗；以及研究者基于专业知识的严谨验证与优化之上。噗啦噗啦实验室的TSA试剂盒（RK50025）具有强大的信号放大能力、优异的稳定性和出色的背景控制，可以帮助您获得清晰、可靠、可重复的实验结果，助您科研一臂之力。