普拉特泽生物承接细胞周期检测、原代及干细胞鉴定、细胞凋亡检测等流式相关服务上万例，积累了操作大量经验

为大家详细分享巨噬细胞极化实验结果，同时为广大科研工作者开展线上的理论培训与线下实操，可承接流式等实验外包服务

做免疫实验的小伙伴，谁还没“养”过巨噬细胞？

作为我们固有免疫和适应性免疫中的关键角色，巨噬细胞简直是免疫界的“变形金刚”。它们的可塑性极强，能根据周围环境信号，极化成不同的功能亚型。

最经典的分型，莫过于M1（经典活化）和M2（替代活化）了。

• M1型： 促炎“战斗机”，负责抗肿瘤、杀病菌。
• M2型： 抗炎“维修工”，负责组织修复、伤口愈合。

为了研究它们，大家通常会从健康人外周血中分离纯化出单核细胞，用M-CSF诱导7天，获得人单核细胞衍生的巨噬细胞（MDMs）。

然后，用不同的“鸡尾酒”去刺激它们，使其极化成不同的亚型：

听起来很简单？但魔鬼藏在细节中。

一个灵魂拷问：你一般在刺激后第几小时去收样检测？

是6小时？24小时？还是48小时？

我们经常发现，文献A说24小时能看到某标志物高表达，文献B说48小时才行，而你自己的实验结果却是阴性……

为什么？

因为目前为止，对于这些标志物检测的“最佳时间点”，业内根本没有统一标准！

巨噬细胞的极化是一个高度动态的过程，不同标志物的表达模式（mRNA和蛋白）随时间变化极大。如果你在“次优”时间点检测，很可能得到“假阴性”结果，这不仅浪费时间，更可能让你与真相失之交臂。

为了解决这个大难题，土耳其Duygu Unuvar Purcu等人做了一件“功德无量”的事：他们把M1、M2a、M2c的所有常用标志物，在4h, 8h, 12h, 24h, 48h, 72h 这一系列时间点上，从mRNA到蛋白水平（流式、ELISA）全都测了一遍！

今天，我们就来“抄一下作业”。

M1型 (促炎“战斗机”)：手快有，手慢无！

用  刺激后，M1的反应非常迅速，但也非常“精分”。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “急性子” (4小时达峰)： CXCL9, CXCL10, TNF 这三个M1关键基因的mRNA水平，在4小时就飙到了顶峰！随后开始逐渐下降。
• 划重点： 如果你习惯性地等到24小时或48小时才去收RNA，你看到的只是“峰后残影”，甚至可能错过整个表达高峰。
• “稳定型” (4小时后稳定)： IL-1β 在4小时显著上调后，能在后续时间点（直至72小时）都保持稳定高表达。
• “晚熟型” (48小时后起飞)： IDO1 是个例外，它的表达随时间持续增加，在48-72小时才达到最高值。
• “最奇怪的” (先降后升)： IL-12 的基因表达在4小时反而下降了，直到48小时才开始显著飙升。

2、蛋白水平 (流式细胞术 & ELISA)

• 流式（表面标志物）：
• CD86 和 HLA-DR 是“短时高峰”，在12小时达到最强，24小时后反而会回落（可能是因为细胞因子IL-10的负反馈调节）。
• CD64 是最可靠的“晚期”M1表面标志物，从8小时开始上调，24-72小时持续走高。
• ELISA（分泌蛋白）：
• TNF（肿瘤坏死因子）在4-12小时分泌量最高。
• IL-1β 在8-24小时这个时间窗口检测最佳。
• IL-12p70 在4小时很低，但在8-72小时都能稳定检测到高水平。

M1小结：M1的反应风风火火。想看基因？4-8小时是黄金时间。想看流式表面蛋白？12小时看CD86/HLA-DR，24小时后看CD64。想看分泌的细胞因子？8-24小时是检测M1“三巨头”（TNF, IL-1β, IL-12）的最佳窗口。

M2a型 (修复“医疗兵”)：耐心，是最大的美德

用  刺激诱导的M2a型，整体反应偏“慢”，需要你耐心等待。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “稳步增长型”： MRC1 (CD206) 和 TGM2 在4小时就被诱导，稳步增长，直到72小时才达到最高峰。
• “持续高能型”： CCL17 在所有时间点都保持非常高的表达量。
• “逐渐上量型”： CCL22 从4小时到48小时逐渐增加。
• “惊天逆转”： 实验发现，在  刺激下，IL-10的mRNA水平居然是逐渐下降的！
• 划重点： 这和很多使用THP-1细胞系（24小时IL-10上调）的报道完全相反！这再次证明了原代细胞和细胞系之间存在巨大差异，做原代细胞不能照搬细胞系的经验！

2、蛋白水平 (流式细胞术 & ELISA)

• 流式（表面标志物）：
• CD200R 和 CD206 (MRC1) 这两个M2a的“金标准”标志物，都是晚期标志物。它们从8小时开始缓慢上调，在48-72小时达到最高水平。
• 划重点： 如果你只刺激了24小时就去看CD206，很可能因为表达量不够高而“假阴性”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 虽然mRNA在M2a中没有上调，但 IL-10 蛋白 确实分泌了！不过非常晚，在48-72小时才能检测到显著水平。

M2a小结：研究M2a表型，“耐心” 是关键词。无论是看流式（CD206/CD200R）还是ELISA（IL-10），都请至少等到48小时，最好是72小时。

M2c型 (抗炎“清道夫”)：mRNA和蛋白的“时差”

用  刺激诱导的M2c型，展现了mRNA和蛋白表达之间巨大的“时间差”。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “早高峰”： IL-10 的mRNA水平在4小时就达到了顶峰。
• “稳定型”： CD163 的mRNA在4小时到72小时都维持稳定表达。
• “人间蒸发”： 在所有检测时间点，均未检测到TGFβ的基因表达！

2、蛋白水平 (流式细胞术 & ELISA)

• 流式（表面标志物）：
• CD163 蛋白的表达在24-72小时开始增加（尽管存在较大的供体差异）。这与4小时mRNA就稳定的情况形成了“时差”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 最大的“时差”来了： 尽管没有检测到TGFβ的mRNA，但在72小时，检测到了非常显著的TGFβ蛋白分泌！
• 划重点： 这说明细胞可能早已转录好mRNA，或者现有的mRNA已足够维持蛋白合成，也可能蛋白是合成后积累在胞内，到晚期才集中释放。千万不要因为qPCR测不到mRNA，就断言没有蛋白功能！

M2c小结：M2c充分展示了科研的复杂性。看mRNA（IL-10）要趁早（4h），看蛋白（CD163/TGFβ）要趁晚（24-72h）。

终极“抄作业”指南：黄金时间表（建议收藏）

说了这么多，一张图（表）总结所有知识点。下次做实验，请直接对照这张表来安排时间！

表1：人单核细胞衍生巨噬细胞中M1, M2a, M2c极化标志物的建议检测时间注：nd (no significant upregulation was detected)，未检测到明显上调。

总结：

1. 没有“一刀切”的时间点： M1标志物（特别是mRNA）反应快，M2标志物（特别是蛋白）反应慢。
2. 原代细胞 ≠ 细胞系： M2a中IL-10 mRNA的下降，警示我们不能盲目套用THP-1等细胞系的数据。
3. mRNA ≠ 蛋白： M2c中TGFβ的表达差异，提醒我们mRNA和蛋白的检测结果必须结合分析，不能相互推断。

有了这份指南，你就可以根据自己想检测的特定标志物，精确安排实验时间，告别“假阴性”，提高实验的重复性和可比性！

快转发给你身边还在为巨噬细胞实验“秃头”的小伙伴吧！或者可直接咨询：18570028002（微信同号）

本文源自流式中文网
如侵则删除