DNA甲基化实验步骤由普拉特泽生物总结分享，上期我们讲到介绍完了DNA甲基化的实验介绍，给第一次接触这个实验的科研小白们做了一个简单的介绍，不记得的可以回去有观看哦——《DNA甲基化实验介绍》。普拉特泽专业承接DNA甲基化实验外包服务，积累丰富的实操经验，今天普拉特泽生物表达检测平台深入的分享一下DNA甲基化检测的操作步骤：

        DNA甲基化检测第一步：引物设计

        在GenBank上找到待检基因启动子区的原始序列，输入到“MethPrimer”软件中，输入启动子序列，选择“Pick primers for bisulfite sequencing PCR or restriction PCR ”，其他参数选择程序默认值，点击“Submit”，“MethPrimer”软件即可显示预测的启动子序列的CpG岛，及引物的相应位置，同时也显示设计的BSP引物。选择多对引物进行预实验，最终确定引物序列。

        DNA甲基化检测第二步：基因组提取

        使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（实验步骤见PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分别提取各样本基因组。提供的细胞量要求大于10^6个。提取浓度在100-400 ng/μL之间，OD 260/280均在1.8-2.0之间，提取质量合格。

        DNA甲基化检测第三步：亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

        （1）将提取获得的基因组DNA 3μg以无菌双蒸水稀释至50μL，然后加入NaOH （终浓度为0.2 M）在42℃水浴变性30 min。

        （2）依次加入30μL10mM对苯二酚（氢醌）、520μL 3 M亚硫酸氢钠（pH=5.0要求精准）至上述水浴后混合液中，轻柔颠倒混匀

        （3）加入200μL石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；50℃避光水浴16h。

        DNA甲基化检测第四步：修饰后DNA纯化回收

        修饰后的DNA使用纯化试剂盒进行过柱纯化，回收后用50µl无菌双蒸水溶解，并测定浓度。

        DNA甲基化检测第五步：PCR扩增

        PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都会影响扩增的成败，需要不断优化。

        DNA甲基化检测第六步：扩增产物回收

        （1）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg=100µL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

        （2）将上述液体全部转移到滤柱内，13000转离心30S（可重复一次）。然后弃掉管内液体，向柱内加入500µL的WA Solution，13000转离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500µL的Wash Solution，13000转离心30S（可重复一次）。然后空离3 min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35 µL的ddH2O，静置5min，13000转离心1.5 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的扩增产物片段，并测定浓度。

        DNA甲基化检测第七步：进行重组反应

        将回收的扩增片段与T克隆载体进行重组，完成回收目的基因与载体的重组过程。

        DNA甲基化检测第八步：转化

        （1）将感受态细胞置于冰上（4℃）待其自然解冻后，取10µl连接产物加入感受态细胞中于冰上（4℃）放置30 min。

        （2）之后于42℃水浴中热击90 S。然后迅速置于冰上（4℃）放置2-3 min。

        （3）加入500µL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45 min。

        （4）3000转离心2 min，弃掉900µL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性（氨苄或卡那等）的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀（涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体），倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。

        DNA甲基化检测第九步：克隆鉴定

        挑起平板多个克隆转化子进行菌落PCR，阳性克隆子再进行测序鉴定，保证最终拿到5个有效样品测序数据。

        好了，实验步骤的详细介绍我们就分享到这里了，有看不懂问题的可以留言给客服，技术会一一解答的哦，当然需要DNA甲基化检测的老师们也欢迎随时联系我们。