Question：细胞侵袭实验常见问题与解决方案有哪些？（普拉特泽生物提供长期稳定的细胞实验外包服务）

    答：前面我们都知道细胞侵袭实验作为探究细胞迁移和侵袭能力的核心技术，广泛应用于肿瘤转移机制、组织修复等研究。然而，实验过程中常常会遇到各种问题，这些问题若不及时解决，会严重影响实验结果的准确性和可靠性。本文将深度剖析细胞侵袭实验中常见的问题，并提供切实有效的解决方案，帮助科研人员顺利完成实验，获取高质量数据。

一、细胞铺板不均匀，导致实验结果偏差

【1】问题表现

在细胞侵袭实验中，细胞铺板不均匀是较为常见的问题。观察发现，Transwell 小室的膜上细胞分布疏

密不，有的区域细胞过于密集，而有的区域细胞数量极少。这种不均匀的细胞分布会使不同小室之间细胞起始状态存在差异，最终导致实验结果出现较大偏差，无法准确反映细胞真实的侵袭能力。

【2】原因分析

造成细胞铺板不均匀的原因有多个方面。首先，细胞悬液制备过程中，若细胞没有充分吹散，会形成细胞团块，在铺板时这些团块会集中在某一区域，导致细胞分布不均。其次，移液操作不规范，如移液枪吸取和吹出细胞悬液时速度过快或过慢，或者移液枪头接触小室膜的位置和角度不一致，都会影响细胞的均匀分布。
此外，小室放置的平台不水平，也会使细胞悬液在重力作用下向一侧聚集，造成细胞铺板不均匀。

【3】解决方案

为解决细胞铺板不均匀的问题，在制备细胞悬液时，应多次轻柔吹打细胞，确保细胞充分分散，可在显微镜下观察细胞悬液，确认无明显细胞团块。移液操作要规范，吸取细胞悬液时，将移液枪头深入悬液底部，缓慢匀速吸取；吹出细胞悬液时，将移液枪头置于小室膜中央上方
垂直缓慢吹出，避免液体冲击导致细胞分布不均。在放置小室前，使用水平仪校准实验平台，保证小室处于水平状态。
通过这些操作，可以有效提高细胞铺板的均匀性。

二、Matrigel 胶凝固异常，影响实验进程

▲问题表现

Matrigel 胶是模拟细胞外基质的重要材料，在细胞侵袭实验中起着关键作用。但实验中常常出现 Matrigel 胶凝固异常的情况，如凝固时间过长，甚至无法凝固；或者凝固后胶层不均匀，出现分层、气泡等现象。这些问题会干扰细胞与胶的正常相互作用，使细胞无法按照预期进行侵袭
导致实验结果不准确，甚至需要重新准备胶液，浪费时间和材料。

▲原因分析

Matrigel 胶凝固异常主要与储存和使用条件有关。Matrigel 胶需要在低温环境下储存，若储存温度过高，会导致胶的成分发生变化，影响其凝固性能。在使用过程中，胶液的稀释比例不当、操作环境温度过高，或者加入胶液后小室晃动、倾斜，都可能导致胶凝固异常。
此外，胶液反复冻融也会破坏其成分结构，使其凝固特性变差。

▲解决方案

Matrigel 胶应严格按照要求在 -20℃储存，避免反复冻融。使用前将胶置于 4℃冰箱缓慢融化，融化过程中不可剧烈晃动。稀释胶液时，要严格按照实验方案的比例进行操作，使用预冷的无血清培养基稀释。在铺胶过程中，保持操作环境低温，可将小室放置在冰盒上进行操作，避免胶液过早凝固。
加入胶液后，轻轻将小室放置在水平位置，避免晃动，待胶在 37℃培养箱中完全凝固后再进行后续操作。

三、细胞侵袭效率低，难以获得理想数据

●问题表现

实验结束后，通过显微镜观察或计数发现，穿过 Matrigel 胶和小室膜的细胞数量极少，细胞侵袭效率远低于预期。这使得实验结果无法清晰展示细胞的侵袭能力差异，对于研究细胞侵袭机制或药物对细胞侵袭的影响等实验目标，难以获得有价值的数据支持。

●原因分析

细胞侵袭效率低可能由多种因素引起。从细胞自身角度看，细胞的生长状态不佳，如细胞传代次数过多、老化，或者细胞在培养过程中营养缺乏、受到污染等，都会影响细胞的活性和侵袭能力。Matrigel 胶的质量和铺胶厚度也会对细胞侵袭产生影响，质量不佳的胶或过厚的胶层会增加细胞穿过的难度。
此外，培养条件不合适，如培养基成分、血清浓度、培养温度和时间等设置不当，也会导致细胞侵袭效率低下。

●解决方案

选择生长状态良好的细胞进行实验，尽量使用低代次、活力高的细胞，在细胞培养过程中，保证培养基营养充足，定期更换培养基，防止细胞老化和污染。严格把控 Matrigel 胶的质量，选择正规厂家生产的产品，并按照推荐的铺胶厚度进行操作。优化培养条件，根据细胞类型和实验需求，调整培养基成分和血清浓度，确保培养温度和时间适宜。
同时，可以设置阳性对照组，验证实验体系的有效性，及时发现问题并进行调整。

四、染色效果不佳，影响细胞观察和计数

□问题表现

在对穿过小室膜的细胞进行染色后，出现染色不充分、细胞着色浅，或者背景染色过深等情况，导致细胞难以清晰观察和准确计数。染色效果不佳不仅增加了实验操作的难度，还会因人为判断误差影响实验结果的准确性。□□□□□□原因分析

染色效果不佳与染色试剂、染色时间和操作方法有关。染色试剂保存不当，如超过保质期、暴露在光照或高温环境下，会使其染色性能下降。染色时间过短，细胞无法充分着色；染色时间过长，则可能导致背景染色加深。在染色操作过程中，清洗不彻底，残留的培养基或其他杂质会与染色试剂发生反应，影响染色效果；
染色后封片操作不当，产生气泡或封片剂涂抹不均匀，也会干扰细胞的观察和计数。

□解决方案

使用前检查染色试剂的保质期和储存条件，确保试剂质量。根据染色试剂的说明书，严格控制染色时间，可通过预实验摸索最佳染色时间。在染色过程中，用 PBS 充分清洗细胞，去除残留的培养基和杂质，染色后再次用 PBS 清洗，洗去多余的染色试剂。封片时，选择合适的封片剂，将封片剂滴在载玻片中央，轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡，若有气泡，可用镊子轻轻按压盖玻片边缘将其赶出。

细胞侵袭实验是一项复杂且精细的技术，实验过程中出现的各种问题需要科研人员认真分析原因
，并采取针对性的解决方案。通过优化实验操作流程、严格把控实验条件和材料质量，能够有效解决常见问题，提高实验的成功率和数据质量，为生命科学研究提供可靠的实验依据。如果你在细胞侵袭实验中还有其他疑问或遇到新的问题，欢迎随时交流探讨，共同攻克实验难题。