今天普拉特泽生物跟大家一起学习的是原代细胞实验的常见问题—应用指南，高达70%的研究因细胞纯度不足、传代变异或功能丢失而失败。
而普拉特泽生物——细胞检测平台也非常重视这一点，为广大科研人员提供原代细胞实验外包服务
同时也总结了在原代细胞实验过程中常遇到的各种问题，分享给大家一起共勉！

效率与稳定性双提升

1. 高活性细胞分离技术

▲防凋亡关键操作：

解离全程使用预冷无钙镁PBS，添加ROCK抑制剂Y-27632（10μM）阻断失巢凋亡；

组织离体后4-6小时内处理，胶原酶浓度严格控制在0.1-0.3mg/mL，辅以DNA酶Ⅰ（100-300U）防止DNA粘稠物包裹细胞。

▲杂质清除策略：

□红细胞污染：ACK裂解液处理2分钟，离心清除；

□成纤维细胞污染：差速贴壁法（接种30分钟移除非贴壁细胞）联合免疫磁珠阴性筛选（抗Fibroblast微珠）。

2. 细胞转染技术革新

▲智能自组装核酸递送：利用液-液相分离（LLPS）机制，在体外形成稳定核酸-蛋白纳米颗粒；

▲高效低毒：人原代T细胞转染效率达85%，且不影响CD34+造血干细胞分化潜能；

▲操作简化：20分钟完成GPCR激活检测，仅需2μL样本量。

从传统药筛到精准医疗

1. 高通量筛选平台构建

●GPCR靶向药筛模型：

瑞士ArcoScreen平台采用微流控384孔板，直接对患者原代细胞进行非放射性筛选，可同步检测Gα亚基偶联作用，使II期临床试验失败率降低50%5；

操作流程：原代细胞+待测化合物 → 滴入试剂 → 荧光读数（20分钟出结果）。

2.高内涵成像应用：

威斯腾生物采用Operetta高内涵分析仪，实时监测药物对细胞迁移、凋亡的多维度影响，适用于肿瘤干细胞靶向药物筛选9。

表1：三大药物筛选平台性能对比

2. 肿瘤个体化治疗模型案例

肾血管平滑肌脂肪瘤模型：

武汉赛尔朗灵团队通过优化培养环境，实现原代细胞传代10代不变异，STR鉴定为全球首例未记录细胞系；

应用价值：基于患者原代细胞筛选mTOR抑制剂（如依维莫司），疗效预测准确性提升40%。

3、疾病模型构建：从基础研究到临床转化

1. 神经退行性疾病模型

原代神经元培养要点：

取材：新生鼠海马组织（离体24小时内处理），0.125%胰酶消化15分钟；

防胶质细胞增生：Neurobasal/B27无血清培养基 + Ara-C（终浓度10⁻⁵mM）处理24小时；

功能验证：诱导21天后检测动作电位，Synaptophysin标记突触形成。

2. 心血管疾病模型

血管平滑肌异常增殖模型：

分离技巧：小鼠主动脉中膜钝性剥离，组织块贴壁法培养（间距0.2-0.5cm），添加20%FBS的DMEM培养基；

表型维持：α-SMA免疫荧光鉴定，PDGF-BB诱导增殖模拟动脉粥样硬化。

3. 罕见病研究模型

肺纤维化模型：

人原代肺成纤维细胞 + TGF-β1（10ng/mL）诱导，α-SMA表达上调提示肌成纤维细胞转化；

药物验证：吡非尼酮抑制胶原分泌率＞60%。

4.实操避坑指南：污染控制与表型维持

1. 污染防控六步法

注：污染率可降至＜1%3

2. 细胞老化的挽救策略

早期干预：

→传代密度控制：贴壁细胞≥1×10⁴ cells/cm²，避免过密导致接触抑制；

→添加抗凋亡因子：Z-VAD-FMK（20μM）阻断Caspase通路。

冻存规范：

冻存液配方：70%基础培养基 + 20%FBS + 10%DMSO；

梯度降温：4℃→-20℃→-80℃→液氮，复苏时37℃水浴≤90秒。

5.、技术融合推动临床转化

类器官-原代细胞联用模型：

肝癌原代细胞 + 肝星状细胞共培养，构建3D类器官，模拟肿瘤微环境药物抵抗；

AI驱动的药效预测：

基于原代细胞转录组数据训练神经网络，提前预判药物敏感性（如赫赛汀在HER2+乳腺癌模型中的响应准确率92%）；

无血清培养基革新：

人源血小板生长因子（hPDGF）替代胎牛血清，降低批间差，满足临床级细胞生产需求。

原代细胞的应用价值建立在三重技术基石之上：

→严格时效性（离体至接种≤6小时）；

→精准微环境模拟（生长因子组合+基质包被）；

→跨尺度功能验证（从免疫表型到电生理活性）

要资质有资质

要经验有经验

要案例有案例

好，原代细胞应用指南就介绍到这里啦~

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