一、双荧光素酶报告基因实验的概念

双荧光素酶是什么？它是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的总称，因为哺乳动物细胞中一般不含有内源性的荧光素酶，那么检测到的荧光信号都是通过转染方式进入到细胞的外源片段所激发的，因此双荧光素酶实验可以用于检测目标片段之间的相互结合关系，而几乎没有背景干扰。常用的双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶。

二、双荧光素酶与双萤光素酶区别

在自然界中存在着各种各样的发光生物，比如节虫、真菌、萤火虫、海参、海星等，很漂亮，也很神奇，其实这里存在着荧光和萤光两种，它们首先在英文表述上存在差异，其次荧光它的发光机制是吸收来自光源的光，再发射另一光子，可以用普通的显微镜来观察。而萤光是化学发光的一种，激发能量来自化学反应，观察检测的装置需要用到发光检测仪，具体到实验当中，荧光常用的是红色荧光rfp或绿色荧光蛋白gfp两种检测。

三、双荧光素酶报告基因实验的优势

 双荧光素酶三大优势：

a.速度优势：样品不需要预处理，不需要孵育

b.灵敏优势：两个酶的线性范围超过7个酶浓度数量级，内源表达极低

c.方便优势：一管完成检测，样品无需分多份

四、双荧光素酶报告基因实验的应用范围

应用范围：双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因。广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

五、双荧光素酶报告基因实验的操作步骤

1、目标选择

2、靶点获取

3、载体构建

4、细胞转染

5、双荧光素酶测定

6、结果分析

前三个步骤主要涉及到分子载体构建，后三个步骤主要讲述细胞方面的，包括细胞转染双荧光素酶的测定以及案例结果分析。

六、双荧光素酶报告基因实验的注意事项

1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温；

2、为取得最佳检测效果，同一批样品最好保证相同的测定时间，通常为10 s；

3、细胞状态及密度会极大影响转染效率；

4、建议使用非血清型或低血清型转染培养基；

5、不同片断类型使用不同的转染试剂；

6、荧光素酶检测试剂需分装后避光操作；

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