WB实验原理合集

大家好！今天普拉特泽生物继续跟大家一起整理了这些疑问部分，希望和大家交流学习~

WB实验(Western Blot，蛋白质印迹)是一种用于检测特定蛋白质在复杂样品中存在及其相对表达量的分子生物学技术其主要步骤为:样品制备→电泳→转膜→封闭→抗体孵育→>检测(显影和成像)

——常见疑问合集

.Marker
1.什么是Marker ?

Maker是蛋白分子量标准，一些已知分子量的蛋白质的混合物，用于指示蛋白质条带的大小。可以类似为一把“尺子”，验证目的蛋白的分子量。

2.Marker的作用是什么?

①指示待测蛋白分子量

②显示蛋白在凝胶上的电泳进度③可协助标记加样顺序4)判断转膜效率

②显示蛋白在凝胶上的电泳进度

③可协助标记加样顺序

④判断转膜效率

3.Marker的分类

①未预染Marker:

优点:非预染蛋白没有附带染料分子或标记分子，指示大小正好是蛋白原本的大小，所以最准确。

缺点:非预染蛋白Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。

②预染Marker:(wb常用)

优点:肉眼看见，可直接观察电泳进程和转膜是否完全，较为常用。

缺点:Marker蛋白跟染料共价偶联导致蛋白分子电泳的迁移效率发生改变，其指示的分子量不是精确值而有一定误差。

3 曝光Marker.

在曝光步骤中，可将目的条带和Marker条带同时曝光显示，减小误差，并克服了预染卄埤燚更肎泱蕗鎴ker迁移率的改变，但价格昂贵

4.预染Marker的选择:

①分子量范围

蛋白marker分为低分子量，宽分子量，高分子量几类。根据需求选择

②质量和稳定性

③与膜的亲和性

二.转膜

1.转膜的原理

将凝胶中分离的蛋白质转移到与其具有高度亲和力的膜上(一般常用pvdf膜)，使蛋白后续更容易与抗体结合，便于后续抗体检测。

原理:利用电场使带负电的蛋白质从凝胶向正极移动，最终附着在膜上。

2.转膜过程中甲醇的作用

转膜液中甲醇的作用∶

① 增强蛋白质与膜的结合

甲醇能去除蛋白质表面的SDS，使蛋白质更容易与膜(如PVDF或硝酸纤维素膜)结合，提高转膜效率。

② 防止凝胶膨胀

结合，提高转膜效率。

② 防止凝胶膨胀

甲醇能防止凝胶过度吸水膨胀，保持凝胶结构稳定，确保蛋白质有效转移。

③甲醇能改善蛋白质从凝胶向膜的转移,特别是对高分子量蛋白质效果显著。

甲醇激活PVDF膜的作用:

①用甲醇激活PVDF膜，可以将膜从疏水性变为亲水性,提高膜对蛋白质的吸附能力。

②甲醇可以减小膜的孔径，让PVDF膜的孔径变小，防止小分子量蛋白质在转膜过程中丢失。

三.封闭

1.孵育一抗体前为什么需要用脱脂牛奶封

闭?

膜具有高蛋白结合能力，可以结合任何可用的蛋白，包括用于检测的抗体。如果不进行封闭处理，抗体可能会非特异性地结合到膜上未被样品蛋白占据的位置，导致高背景信号

合到膜上未被样品蛋白占据的位置，导致高背景信号。

封闭的作用

①减少非特异性背景:封闭剂通过占据空白位点，阻止抗体非特异性结合，从而降低背景噪音，使条带更清晰。

②增强特异性信号:有效的封闭可以帮助抗体更专一地结合到其目标蛋白，提高检测的特异性。

(脱脂牛奶是最常用的封闭剂，成本低廉且富多种蛋白。但不宜用于磷酸化蛋白检测，磷酸1蛋自尽量使用BSA)

四.孵育抗体

1.一抗二抗的原理，为什么需要使用二抗?

原理

一抗的作用是特异性识别目标蛋白的某个抗原表位，这个过程是由一抗的可变区(Fab区)完成的。二抗识别并结合一抗的恒定獯竣区(Fc区)，而不是目标蛋白本身

四.孵罈哩育抗体

2.一抗二抗的原理，为什么需要使用二抗?

原理:

一抗的作用是特异性识别目标蛋白的某个抗原表位，这个过程是由一抗的可变区(Fab区)完成的。二抗识别并结合一抗的恒定区(Fc区)，而不是目标蛋白本身。

3.为什么需要使用二抗？

①二抗可以通用

同一种动物来源的抗体恒定区是相同的,因此只需要制造一种通用的二抗(如抗免二抗)就可以用于所有由免子产生的一抗，无论这些一抗识别的是哪种蛋白。②放大信号

一个一抗可以结合多个二抗，多个二抗的结合带来了更多的信号分子，从而增强目标蛋白的信号。

4.稀释一抗二抗一般使用什么液体?
一抗稀释配方:

500mI TBS/TBST

因此只誌需要制造一种通用的二抗(如抗兔二抗)Ş方可以用于所有由免子产生的一抗，无论这些一抗识别的是哪种蛋白。②放大信号

一个一抗可以结合多个二抗，多个二抗的结合带来了更多的信号分子，从而增强目标蛋白的信号。

3.稀獯闾释一抗二抗一般使用什么液体 ?

一抗稀释配方:500mI TBS/TBST5gBSA(牛血清蛋白)500ul proclean(抑菌防腐剂)比例 1:2000~3000二抗玗肃觖法嬙啶遭释配方:PBST/TBST+5%BSA(血清白蛋白)比例 1:5000~60000

(Tween-20可以帮助稀释的二抗均匀分散，并提高其与目标蛋白的结合。

BSA可以作为阻断剂，降低非特异性结合，提高实验的特异性）

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