本文普拉特泽生物就给小白们从qPCR原理方法细细讲讲，梳理夯实一下基础。
一、QPCR检测原理

QPCR，即实时荧光定量聚合酶链式反应，是一种在生物医学研究、分子诊断和基因表达分析等领域广泛应用的技术。其基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光标记的特异性探针，通过在每个反应循环中实时监测荧光信号的增强，实现对起始模板的定量。

QPCR实验

  qPCR的核心在于使用荧光染料或者探针，利用荧光信号的变化实时监测PCR反应过程。荧光染料通常与双链DNA结合，随着DNA的合成，荧光染料被释放出来，产生荧光信号。而荧光标记的特异性探针则通过与目标序列结合，在PCR过程中被酶切，释放出荧光信号。这两种方式都能实现PCR反应的实时监测。

二、qPCR数据处理

①数据收集：

在qPCR实验中，数据收集主要涉及记录每次实验的Ct值（阈值循环数）。这些数据反映了样本中目标DNA片段的扩增情况。除了Ct值，实验中其他重要的参数，如样本质量、引物特异性等，也需要被详细记录。

②数据整理：

收集到的原始数据需要被整理成表格形式，便于后续分析。这些表格应包括每个样本的Ct值、任何与样本质量相关的信息（如DNA浓度）以及实验的其他关键参数。

qPCR的疑难杂问解答

③数据标准化：

为了消除实验中不同样本间潜在的差异，如DNA浓度和PCR效率等，需要进行标准化处理。一种常见的方法是使用管家基因（housekeeping gene）进行标准化，因为这些基因在所有样本中表达稳定。标准化步骤是数据处理的关键环节，能显著提高数据分析的准确性和可靠性。

④数据分析：

数据分析涉及对标准化后的数据进行处理，以找出模式、趋势和差异。常见的数据分析包括比较两组或多组数据的均值、中位数、标准差等统计量，以及进行统计分析，如t检验、方差分析等。数据分析的目标是揭示基因表达的潜在规律和差异。

⑤数据分析结果的解读：

最后，解读数据分析结果是一个关键步骤。结果解读应基于对实验目的和所研究生物学过程的理解。在解读结果时，应关注显著性差异、表达模式的一致性和差异性等方面。同时，应注意排除可能的异常值和离群点，以确保结果的准确性和可靠性。

QPCR熔解曲线图

⑥质量控制和可重复性：

为了确保数据的准确性和可靠性，需要进行严格的质量控制和重复实验。质量控制包括对实验过程的监控和对结果的验证。此外，重复实验有助于评估实验的可靠性和可重复性。在数据处理过程中，应剔除不符合质量要求的实验数据，以保证结果的准确性。

qPCR技术以其独特的优势在生物学研究中发挥着重要作用。了解其原理和数据处理方法对于准确获取实验结果至关重要。通过不断学习和实践，我们将更好地掌握这一个技术。

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