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免疫共沉淀—实验操作流程和步骤

2023-04-12 15:45:52

来源/作者:普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

  这次普拉特泽生物继续为广大生命科学研究人员提供免疫共沉淀实验外包服务,可根据实方案的要求选择不同的检测方法,让我们一起学习免疫共沉淀的实验操作流程和步骤吧:


下面是免疫共沉淀实验的实验步骤和操作流程:

    1. 样品处理:将细胞或组织样品进行裂解,得到待检测的蛋白质混合物,并加入蛋白酶抑制剂以避免目标蛋白被降解。样品来源可以是生物内提取、组织培养等。


    2. 共价固定抗体:将专一的抗体连接到亲和树脂上(如蛋白A的亲和树脂或蛋白G的亲和树脂)或将蛋白与其特异性抗体结合,新形成的复合物与封闭剂缓慢摇摆在二氧化硅珠上,将COOH基与Si-OH钝化,使碘酸钙交联后节制反应。


    3. 免疫共沉淀:将有抗体树脂的样品与吸附抗体树脂形成免疫复合物,INCUBATE用于免疫沉淀。硫酸铵沉淀可用于纯化蛋白。


    4. 洗涤:采用洗涤缓冲液对样品进行洗涤,以去除非特异性的蛋白质和杂质,同时尽量避免对复合物的影响。洗涤缓冲液选择对样品不会引起较大影响的缓冲液和洗涤剂。


    5. 后续实验:将沉淀的复合物通过SDS-PAGE分离出来,并进行Western blotting检测目标蛋白及其配偶蛋白。另一方面,也可以直接使用质谱分析检测。


    总之,免疫共沉淀实验是一种通过抗原-抗体相互作用来捕获特定蛋白质交互作用信息的高通量低污染方法。在进行实验时,在样品处理、试剂准备等关键步骤上需注意实验设计并设置对照实验,以确保得到可靠的结果。


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