普拉特泽生物为广大生命科学研究人员提供EdU细胞检测实验，可根据实方案的要求选择不同的检测方法，本文就跟大家一起继续探究EdU-CCK8双轨验证细胞活性与增殖~~

单一检测指标常导致假阳性/假阴性误判——CCK8仅反映代谢活性，无法区分静息细胞；EdU只标记DNA合成，可能漏检凋亡干扰。普拉特泽生物开发的EdU-CCK8双轨验证方案，可在96/384孔板中同步解析细胞真实增殖状态与存活率，精准识别抑制增殖型、细胞毒型、代谢干扰型药物，误判率降低90%

（一）、单指标检测的致命缺陷

█ 传统单指标陷阱

█ EdU-CCK8双轨验证的核心价值

同步获取两大维度数据：

EdU⁺% = 真实增殖细胞比例

CCK8活性 = 总存活细胞量

计算黄金指标：

增殖活力指数 (PVI) = (EdU⁺% × CCK8 OD值) / 对照组值 × 100%

→ ＜30%：强效抑制增殖药物

→ 30-70%：中度抑制

→ ＞70%且CCK8骤降：提示细胞毒作用

（二）、高通量双轨方案全流程（96孔板为例）

█ 实验设计模板

█ 分步避坑指南

Step 1: 细胞铺板与给药

细胞密度优化：

→肿瘤细胞：2000-5000/孔（24h后达30%融合度）

→原代细胞：5000-8000/孔

关键细节：

→边缘孔填充PBS防蒸发→ 避免“边缘效应”

→设三重复孔 + 无细胞背景孔 + DMSO溶剂对照

Step 2: EdU脉冲标记

时机：药物处理结束前2小时加入EdU

浓度：

●快速增殖细胞：10μM EdU

●慢周期细胞：20μM EdU

避坑：用预温的无血清培养基稀释EdU，防止血清干扰

Step 3: CCK8检测（先测活细胞）

每孔加10μl CCK8试剂（终浓度10%）

37℃孵育1-4小时（显色避光）

酶标仪检测450nm吸光度（参比650nm）

注意：显色后立即检测，避免甲臢沉淀

Step 4: EdU固定与染色

温和固定：每孔加40μl 4% PFA（室温15min）

通透处理：0.5% Triton X-100（PBS配制）20min

Click反应：

——每孔加50μl Click反应液（含AF647染料）

配方：

* 1mM CuSO₄

* 2mM 抗坏血酸钠

* 5μM AF647-azide

* 溶于PBS（现配现用）

避光孵育30min，PBS洗2次

Step 5: 高通量成像分析

设备：自动荧光显微镜（如Molecular Devices ImageXpress）

参数：

激发/发射：640nm/680nm（EdU-AF647）

扫描：每孔取9视野（覆盖中心与边缘）

软件分析：

EdU⁺细胞数：MetaXpress/MIAs软件自动识别荧光核

细胞总数：DAPI/Hoechst染色计数

增殖率 = EdU⁺细胞数 / 总细胞数 × 100%

（三）、双轨数据解读与药物作用模式鉴定

█ 四类药物的特征响应

案例：紫杉醇处理乳腺癌MCF-7细胞

• 数据：EdU⁺%下降80%，CCK8仅降20%

• 结论：属于强效抑制增殖型（阻滞M期），而非细胞毒性

（四）、关键优化点与避坑策略

1. 时序冲突破解：先CCK8后EdU染色

• 矛盾点：CCK8含甲臢染料→淬灭荧光

• 方案：
  先测CCK8吸光度 → 移除CCK8液 → PBS洗1次 → 再固定染色

2. 孔间交叉污染预防

• 移液技巧：使用多通道移液器+低吸附枪头

• 防蒸发：铺板后覆盖透气密封膜（如Breathe-Easy）
  

• （五）、实战案例：抗纤维化药物筛选

• █ 模型：肝星状细胞LX-2（诱导纤维化）

• 药物库：200种天然化合物

• 双轨结果：

• →化合物A：EdU⁺%↓70%，CCK8↓10% → 抑制增殖候选药

• →化合物B：EdU⁺%↑20%，CCK8↓60% → 细胞毒性（弃用）

• →靶点验证：化合物A显著下调α-SMA和Collagen I表达（Western blot）

• 六、升级方案：类器官与活细胞动态追踪

• █ 三维类器官双轨检测

• 操作调整：

• EdU标记后→ 类器官解离为单细胞 → CCK8检测

• 或采用ATP检测（如CellTiter-Glo®）替代CCK8

• 优势：模拟体内微环境，预测临床响应更准确

• █ 活细胞动态监测（IncuCyte®整合）

• EdU标记期间启动延时成像

• 自动追踪：

• ▲细胞增殖：EdU⁺细胞数变化

• ▲细胞死亡：膜通透性染料（如Sytox Green）

• ▲结果输出：增殖-死亡动态曲线（识别药物作用时间窗）
  

• EdU-CCK8双轨验证通过同步捕获DNA合成与代谢活性，彻底规避单指标误判风险。结合96/384孔板自动化操作与智能算法分析，可在7天内完成千级化合物库的精准初筛，误判率＜5%。随着类器官与活细胞成像技术的整合。

• 要资质有资质

• 要经验有经验

• 要案例有案例

• 好，EdU-CCK8双轨验证细胞活性与增殖就介绍到这里啦~

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