ChIP实验全流程深度由普拉特泽生物分子检测平台总结分享，分子检测平台为广大科研实验人员提供ChIP实验外包，先一起来学习学习从样本制备到结果验证

一、ChIP实验概述与原理

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是研究蛋白质与DNA相互作用的关键技术，广泛应用于转录因子结合位点、组蛋白修饰等表观遗传学研究领域。

核心原理：通过特异性抗体富集与目标蛋白结合的DNA片段，结合高通量测序(ChIP-seq)或qPCR分析，精确定位蛋白-DNA相互作用位点。

图1

二、样本制备关键步骤与优化策略

2.1 细胞培养与处理

细胞状态控制：确保细胞处于最佳生长状态(对数生长期)

交联条件优化：1%甲醛室温交联10-15分钟(根据细胞类型调整)

终止反应：使用终浓度0.125M甘氨酸终止交联

2.2 染色质片段化技术

超声破碎参数：

Bioruptor®推荐条件：30秒ON/30秒OFF，15-20个循环(4°C)

片段大小目标：200-500bp(需电泳验证)

酶解法(Micrococcal Nuclease)替代方案：适用于组蛋白修饰研究

2.3 质量控制要点

片段大小检测：1.5%琼脂糖凝胶电泳

浓度测定：Nanodrop或Qubit定量(建议≥50μg/反应)

三、免疫沉淀核心操作技巧

3.1 抗体选择标准

验证过的ChIP级抗体优先(查阅CST或Abcam数据库)

阴性对照：同型IgG对照

阳性对照：H3K4me3(活跃启动子标记)或H3K27me3(抑制性标记)

3.2 磁珠预处理

Protein A/G磁珠比例：根据抗体亚型优化(通常1:1混合)

封闭步骤：0.5% BSA+0.2mg/ml鲑鱼精DNA预处理1小时

3.3 结合条件优化

孵育时间：4°C过夜(12-16小时)

洗涤缓冲液配方：

低盐：20mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl

高盐：20mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl

图2

四、DNA纯化与质量检测

4.1 解交联条件

65°C水浴6小时(含5M NaCl和10mg/ml蛋白酶K)

4.2 纯化方法选择

酚-氯仿抽提法：回收率高但操作复杂

硅胶柱纯化法：推荐使用QIAquick PCR Purification Kit

4.3 质量评估指标

浓度要求：≥1ng/μL(ChIP-seq)

完整性检测：Agilent 2100 Bioanalyzer(避免RNA污染)

五、下游分析技术选择

5.1 ChIP-qPCR验证

引物设计原则：

长度18-22bp，Tm值60±2°C

扩增片段80-150bp

数据分析方法：ΔΔCt法计算富集倍数

5.2 ChIP-seq文库构建

末端修复：T4 DNA聚合酶/Klenow片段混合系统

接头连接：推荐使用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit

六、常见问题解决方案

6.1 低信号处理策略

抗体滴定实验：测试1-10μg抗体用量

增加起始材料：建议≥1×10^7细胞/反应

6.2 高背景解决方案

增加洗涤严格度：加入0.1% SDS或LiCl洗涤

DNase处理磁珠：去除非特异性DNA结合

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