上期我们分享原位杂交检测实验报告（三）大家都说不够详细，有一些关于其他检测报告没有写出来，那今天普拉特泽生物就为大家专门出一期原位杂交检测实验报告（四）：

一、实验目的

用原位杂交技术在原位研究组织细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。

二、实验原理

用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。基本原理--碱基互补配对原理。

三、实验结果

图1  FISH染色图

四、实验结论

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的绿光（lncRNA-MAF5L）和红光（MAF5

五、实验材料

1.主要仪器

2.  主要试剂

六、实验步骤

准备:                                        

1）lncRNAProbeMix储存液（20μM），恢复至室温。

2）U6，18S内参探针储存液（20μM），恢复至室温。

3）预杂交液：将适量BlockingSolution与Pre-hybridizationBuffer按照1：99混匀后，37℃孵育至透明澄清状态（约30min）后，分装保存。在使用前，须在37℃气浴或水浴中孵育至澄清透明。

4）杂交液：将适量BlockingSolution与HybridizationBuffer按照1：99混匀，37℃孵育30min后分装保存。在使用前，须先在37℃气浴或水浴中孵育30min。杂交液颜色偏黄属于正常现象。注：Pre-hybridizationBuffer（试剂A）和HybridizationBuffer（试剂B）从低温取出时可能有沉淀析出，属于正常现象。

5）将适量100XDAPI染色液（试剂D）与PBS按照1：99混匀，制备1XDAPI染色液。

自备试剂：1）通透液（含0.5%TritonX-100的PBS）2）1XPBS3）4XSSC4）杂交洗液I（4XSSC，0.1%Tween-20）5）杂交洗液II（2XSSC）6）杂交洗液III（1XSSC）7）封片剂。

1.切片脱蜡水化。

2.样本上加入适量预冷的【通透液】，室温静置30min；弃去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗细胞5min，3次。

3.探针检测

a.每个样本加入200uL【预杂交液】，37°C封闭30min；

b.预杂交同时，将【杂交液】在37°C中预热；

c.避光条件下，把2.5uL20uM【lncRNAFISHProbeMix储存液】或【内参FISHProbeMix储存液】加入到100μl【杂交液】中；注：探针浓度可根据具体实验情况进行优化。

d.弃去每个样本上的【预杂交液】，加入100uL含有探针的【探针杂交液】，避光，37°C杂交过夜。

e.避光，42°C，【杂交洗液I】清洗样本3次，每次5min，以降低背景信号；

f.避光，42°C，【杂交洗液II】清洗样本1次；g.避光，42°C，【杂交洗液III】清洗样本1次；h.避光，【1XPBS】清洗样本，室温5min。注：所有指定温度的步骤，注意将相关试剂预热到对应实验所需温度后再使用。

4.核染色a.避光，【1XDAPI染色液】染色10min，染色液用量以覆盖待杂交区域所有样本为宜；b.避光，【1XPBS】清洗样本3次，每次5min。

5.封片避光条件下，取出切片，用封片剂将盖玻片固定其上，进行荧光检测。

还有更多疑问建议或需要原位杂交实验外包的同学可点击“普拉特泽”了解咨询哦，提供原始数据，死磕真实实验！