RIP检测实验步骤由普拉特泽生物为大家总结分享。RIP就是RNA结合蛋白免疫沉淀，是研究体内 RNA 与蛋白结合情况的技术。普拉特泽生物分子检测平台为广大科研人员提供长期稳定的RIP检测外包服务，本文就给大家分享RIP检测技术给大家总结的实验步骤：

        一、RIP检测原理与实验原理

        RIP实验原理：RIP实验是研究RNA-蛋白之间的相互作用，运用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，通过免疫学方法将RNA-蛋白复合物一起分离出来，通过对目的片段的纯化与检测（结合的RNA序列通过microarCALU-1y（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定），从而分析蛋白质和RNA相互作用的信息。

        RIP检测实验准备：

        1、仪器准备：台式冷冻离心机、涡旋振荡器、电子天平、PCR仪、移液器、凝胶成像系统、电泳仪、水平电泳槽、洁净工作台、-80度冰箱、数显恒温水浴锅

        2、试剂准备：无水乙醇、苯酚：氯仿：异戊醇、RIP试剂盒、1.5 mL EP管、2 × PCR MIX、IGF2BP2抗体

        二、RIP检测实验操作步骤

        1、设计引物

        2、细胞裂解

        （1）加入1 mL PBS洗涤细胞，室温1000 rpm离心5 min收集细胞弃上清；重复一次。

        （2）细胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer，9 µL Protease inhibitor，4.5 µL RNase inhibitor涡旋混匀，冰上放置 10 min。

        3、去除 DNA

        （1）细胞裂解液中加4.5 μL DNase salt stock、10 μL DNase (20 U)，37℃温育10 min。

        （2）转移样品到冰浴环境，快速加入4.5 μL 0.5 M EDTA、1.8 μL 0.5 M EGTA、9 μL DTT，混匀。

        （3）4℃，16,000 g 离心10 min转移上清至新的无RNase离心管中。

        4、平衡 protein A/G

        （1）每组RIP样品准备20 µL protein A/G beads，加入0.5 mL polysome lysis buffer，颠倒混匀，磁力架上去上清； 重复洗一次。

        （2）加入20 µL polysome lysis buffer 恢复初始体积。

        5、免疫沉淀

        （1）将细胞裂解样品按照0.8 mL（IP）、0.1 mL（Input）分成两份，Input样品-80℃保存备用。

        （2）IP 样品加入实验抗体或者IgG（阴性对照），垂直混匀器 4℃孵育16 h（过夜）。

        （3）IP 样品加入准备好的20 µL protein A/G beads，垂直混匀器 4℃孵育1小时，磁力架收集磁珠并去上清。

        （4）IP 样品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、 5 µL DTT洗涤三次去上清， 每次4℃孵育5分钟。

        （5）IP 样品中加入94.5 μL polysome washing buffer 1、 0.5 μL DNase salt stock、5 μL  DNase (5 U)，37℃温育10 min后去上清。

        （6）IP 样品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5 µL DTT洗涤两次去上清，每次4℃孵育5分钟。

        （7）IP样品加入100 µL polysome elution buffer、1 µL DTT及2 µL proteinase K重悬珠子，Input样品加入1 µL DTT及2 µL proteinase K。

        （8）55℃孵育1 h，洗脱RNA，磁力架收集磁珠转移上清至新的无RNA酶离心管中。

        6、提取 RNA

        （1）上清加入等洗脱体积(100 µL)苯酚-氯仿-异戊醇混合液到IP和Input样品，颠倒混匀15秒。

        （2）13000 g，4℃离心10分钟，收集上层水相，转移到新无RNA离心管中。

        （3）加入1 µL Glycogen，10 µL sodium acetate及250 µL 100% ethanol充分颠倒混匀。

        （4） –20℃静置3 h到过夜沉淀RNA样品。

        （5） 4℃，16000 g 离心30分钟，弃上清。

        （6）加入1 mL预冷的80%乙醇，4℃，16100 g 离心10分钟，弃上清，室温风干10分钟。

        （7）加入30 µL RNase-free water溶解RNA，-80℃保存。

        7、RNA检测

        （1）取2 μL RNA样品检测RNA浓度。

        7.8 结合RNA效率验证（PCR)

        （1）参考逆转录试剂盒说明书逆转录RNA样品。

        （2）参考PCR试剂盒配置反应体系进行PCR，取10 µL PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳。

        RIP检测实验步骤就讲完啦，如果您还有什么实验技术问题或有RIP检测外包的需求欢迎随时联系普拉特泽生物~

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