大家好，今天普拉特泽生物跟大家一起学习的是TUNEL染色实验的常见问题与解决方法。普拉特泽生物—病理实验平台承接了大量的TUNEL检测细胞凋亡代测实验与技术咨询服务，同时在实操过程中也遇到了很多特殊的实验结果，今天小编就把普拉特泽生物技术在用TUNEL检测细胞凋亡时遇到的各种问题极其解决方法总结给大家，希望能在实验的操作中给到大家一定的帮助！

        问题一、荧光信号弱或没有荧光信号

   原因1：样本处理不当

        （1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。

        （2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min，再使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。

        （3）Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间，常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

        （4）Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL。

        （5）放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜，减低染色效率。建议使用新鲜切片。

         原因2：染色操作不当

        （1）染色时间过短。建议一般 37 °c 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

        （2）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。

        （3）TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致TdT酶失活。

        （4）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。

         原因3：荧光检测操作不当

        主要是因为操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。

        问题二、非特异性染色（假阳性高）

        原因1：样本处理不当

        （1）使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。

        （2）固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

        （3）固定时间过长，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min。

        （4）蛋白酶K处理时间过长，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当缩短处理时间。

        （5）蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶K溶液浓度，一般工作液浓度为20 μg/mL。

        原因2：染色操作不当

        （1）TUNEL染色时间过长。建议一般是 37 °c 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

        （2）未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。

        问题三、荧光背景强

        原因1：样本操作不当

        （1）TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当，一般是 37 °c孵育60 min，避免串色。

        （2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。

        （3）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。

        原因2：荧光检测操作不当

        曝光时间过长。建议调整曝光条件，先对阴性组调整到无背景光，然后用这个曝光条件去拍摄实验组（可以微调，但是不需要大调）。

        
       好啦，那TUNEL染色的几个常见问题咱们就介绍到这里啦，您还有遇到其他的问题，欢迎给我们留言，我们会回答后加到这片文章中跟大家一起学习哦！

        如果您有用TUNELl或流式代测细胞凋亡的需求的话，请相信——普拉特泽！