免疫组化/IHC实验操作步骤由普拉特泽生物旗下科研培训品牌——春风学院为大家总结分享。普拉特泽病理实验平台承接免疫组化/IHC几百例，动植物各部位切片都有实操的经验，在广大科研小白的技术咨询中我们终于总结了这篇免疫组化的注意事项出来供大家参考学习。

        1、切片固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对干冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻好，但对干不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合的固定液，使用前请注意查看说明书。

        2、组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整

        3、切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

        4、烤片：60℃30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

        5、蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

        6、脱片问题：多聚赖氨酸为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化，微波，高温高压的防脱片处理。7、灭活内源性酶：HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活

        7、暴霞抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

        8、封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭。

        9、抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

        10、背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1%Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

        11、返蓝：在苏木精复染后，可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HPOA的饱和溶液

        返蓝。

        12、显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

        13、在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

        好啦，那免疫组化/IHC的注意事项咱们就总结到这里啦，想更进一步学习免疫组化的技术可以点击《免疫组化/IHC 理论+实操》跟着视频学习文献与操作。如果有同学需要免疫组化代做与外包的同学欢迎留言，认准普拉特泽哦。