本文由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》分享，春风学院提供线上视频课程培训，线下实操一对一带教，是你快速掌实验技能的好帮手哦，关于Western blot检测详细的实验步骤及实验干货输送，篇尾有视频教程方便大家理解

   Western blot检测实验是科研造假的重灾区，WB检测其操作上手难度也名列前茅，就连大部分实验老手也饱受折磨，所以想要获得一张漂亮的WB结果非常不容易。

 相信每个做WB（蛋白质免疫印迹）实验的高手都有一些自己的独门经验，而普拉特泽生物做为依托互联网从事线上实验服务外包服务，并面向全国承接实验外包的生物科研公司，分子生物学实验中的WB检测也承接了数以千记的的WB实验项目，积累了大量的WB检测案例，为广告科研工作者提供实验步骤的教学与培训服务。

   好了废话不多说上正菜!WB检测实验步骤:
   WB检测第一步：准备蛋白样本
   （1）首先在显微镜下观察确保收集健康的、按预期生长的wb检测的细胞样本。

 
  WB检测第二步：SDS-PAGE凝胶电泳   

   (1) 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手用无尘布轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后晾干。未彻底清洁干净容易导致蛋白质印迹跑胶痕迹不清晰，wb实验结果分析造成困扰。

   (2) 组装制胶器：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，加满纯水或蒸馏水进行试漏，5 min左右液面不下降即可。

   (3) 配制分离胶：根据目标蛋白的分子量来确定分离胶的浓度。目标蛋白的分子量越小，丙烯酰胺/bis 的百分比越高。目标蛋白的分子量越大，丙烯酰胺/bis 的百分比越低。按配5%分离胶为例，按下表比例配制好胶液，动作尽量迅速。特别注意，TEMED起凝胶作用，所以待一切都准备就续再最后加入TEMED，混匀后立即灌胶。灌胶时，可用10 mL移液器吸取，沿内侧玻璃壁缓慢放出，1.5 mm厚的玻璃板灌胶约6-7mL左右。最后在分离胶上加1 mL 75%酒精。

western blot实验 分离胶的配方

   （4） 配制浓缩胶：同样以配制5％的浓缩胶为例。待分离胶凝固，倒出封液的酒精。按配方配制分离胶，同样注意最后加入TEMED，而后混匀（不要剧烈摇晃，避免产生气泡）即可灌胶。将板中剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。插梳子时从一侧倾斜插入，最后使梳子保持水平（避免梳子底下有气泡）。灌胶时也要沿玻璃板缓慢流下以免胶中有气泡产生。

western blot实验 5%浓缩胶的配方

   （5） 上样：加足够的电泳缓冲液后开始准备上样(电泳缓冲液至少要漫过内侧的小玻璃板)。然后平稳拔出梳子，速度不宜过快，避免加样孔变形。尽量保证每个加样孔的形状一致（可用镊子将胶拨正）。用10μl移液枪吸取7-10μl样品缓慢加入加样孔中（每孔样品量保持一致，避免条带长短不一），根据实验需要在未加样的任意孔加3μl蛋白marker或同体积的1×Loading buffer。

   （6） 电泳：电泳时电压为80V，当marker进入分离胶（可看到不同颜色的marker条带时），可将电压调整至120V，电泳至溴酚蓝跑至胶底即可终止电泳，进行转膜。
 

    WB检测第三步转膜：

   （1）转膜需准备适量滤纸和1张与胶同等大小的PVDF膜。PVDF膜大小需要根据胶的大小来裁剪，在裁剪时注意不要用收直接接触PVDF膜。切好的PVDF膜还需于甲醇中浸泡10s，再于转膜缓冲液中浸泡5min后使用；

   （2）在倒有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子，夹子每边各垫一层海绵垫及适量滤纸（转膜液的量宜没过夹子）。

   （3）用切胶尺撬开玻璃板，撬的时候动作要轻。切去非目的蛋白部分，小心剥下分离胶放置在夹子黑色面，用手或切胶板调整使其与滤纸对齐，轻压擀去气泡。将适宜大小的膜覆盖在胶上擀去气泡。在膜上盖滤纸并除去气泡。将夹子另一面盖上并夹紧，放入转膜槽，夹子黑色面对槽的黑面，夹子白色面对槽的红面。整个操作在转膜缓冲液中进行，操作时尽量避免胶与膜之间有气泡（转膜液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）。
    

WB检测第四步 免疫反应：

   （1）封闭：将膜移至含有5%脱脂牛奶粉（1×PBST溶解奶粉）封闭液的孵育盒中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h左右

   （2）一抗孵育：将一抗用5%BSA稀释至适当浓度（根据抗体说明书调整抗体稀释比）。从封闭液中取出膜，用PBST或水洗去残留封闭液。将膜放入新的孵育盒，加入稀释后的一抗，置于4℃冰箱孵育过夜或室温摇床孵育1h以上，孵育结束后，用PBST洗膜。

   （3）将二抗用PBST稀释至适当浓度（根据抗体说明书调整抗体稀释比），室温下孵育1h后（或者37℃恒温箱孵育10-15min），用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5-10min。
     

WB检测第五步化学发光：  

   （1）根据wb检测试剂盒说明书，配制显影液。
   （2）将孵育完成的膜用镊子将其平铺在平板上，移液枪吸取发光底物，均匀覆盖膜。  

   （3）将平板放入显影仪。

   最后就是进行整个western blot（蛋白质免疫印迹）实验结果的拍照与总结分析啦，回顾整个实验过程，详细步骤其实就是：提取细胞蛋白、BCA定量、制备蛋白胶、蛋白样本变性、电泳、转膜、一抗、二抗、显影、结果分析。
   是不是很简单呢？wb检测的详细实验步骤如果您还有实验过程中的疑问可以关注咱们的春风学院——western blot（理论+实操）篇，或报名进行线下一对一wb检测培训，分WB检测理论分析和WB实验操作演示，进行系统性的学习实际操作与结果分析哦。

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