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分子生物学实验介绍-PCR篇

2021-12-31 10:05:32

来源/作者:普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

PCR是生物领域中最基础,也是尤为重要的一环

今天给大家讲述一些

PCR应该了解的知识 与 实验出现问题的解决办法

首先给大家详细介绍下其原理

PCR(Polymerase Chain Reaction)原理:

即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

分子生物学实验介绍-PCR篇


介绍了原理,少不了得说其几个重要体系成份

1.模板(Template):基因组、质粒DNA、cDNA、也可以是细菌、组织样品等。

2.引物(Primer):确定扩增目的序列打的特异性;确定扩增引物长度。

3.DNA聚合酶(DNA Polymerase):推动PCR反应进行的机器。

4.缓冲液(Buffer):控制体系的pH和离子,为DNA聚合酶提供最佳工作环境。

5.脱氧核苷酸(dNTP):DNA的基本组成元件,包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。

6.Mg、K离子增强剂。


而我们在PCR实际操作过程中会遇到很多不可避免的问题,比如说:PCR产物条带拖尾,有杂带,更严重的是除了marker外,啥条带都看不到。

分子生物学实验介绍-PCR篇
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那我们应该如何有效的避免出现这些问题呢?

首先得找出出现这些问题的原因,才能有效解决问题。

常见的问题有很多种,但绝大部分能总结出以下几点。

问题一:完全没有条带

1.确认试剂是否存在质量问题或者加样时出错,导致反应体系不完整。

2.检查模板DNA是否正确或者存在特殊结构,导致模板与引物无法结合。

3.引物或反应温度设计不合理。


问题二:有很多非特异性条带

1.反应体系被污染。

2.引物特异性差。

3.退火温度不合适。


问题三:目的条带弱

1.聚合酶活性过低。

2.循环次数偏低。

3.模板DNA浓度过低。


问题四:PCR产物出现片状拖尾

1.DNA聚合酶过多或酶活性差。

2.dNTP和Mg离子浓度过高。

3.退火温度过低,PCR循环数偏多。

4.模板DNA用量过大或模板DNA不纯。

5.引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异性扩增。


知道了问题的出现原因,就能有效的针对并改变PCR条件,跑出漂亮的条带了。最后祝大家,PCR每次都能成功扩出目的条带。

分子生物学实验介绍-PCR篇


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