本文就给小白们从样本处理到数据解读细细讲讲，梳理夯实一下基础。

细胞增殖实验是评估细胞活性、药物毒性及肿瘤生长机制的核心技术。然而，由于操作细节繁多，实验失败率高达40%。普拉特泽生物结合《Nature Protocols》最新标准与实验室实战经验，系统解析实验全流程，并提供10大避坑技巧，助大家轻松获得可靠数据！

一、实验方法选择：四大主流技术对比

选择建议：

初筛实验 → MTT（低成本）

精准定量 → CCK-8（操作简单）

单细胞分析 → EdU（高分辨率）

二、实验全流程分步解析

1. 样本处理：细胞培养与准备

关键步骤：

1.细胞复苏与传代：

2.使用对数生长期细胞（传代次数≤10）。

3.胰酶消化时间控制（贴壁细胞：37℃ 2-5分钟）。

细胞计数与铺板：

1.自动细胞计数器确保精度（推荐Countess II）。

2.铺板密度参考（贴壁细胞：5×10³~1×10⁴/孔）。

避坑指南：

1.避免使用过密或过稀的细胞（OD值偏差>20%）。

2.预实验确定最佳密度（梯度测试3个浓度）。

2. 试剂准备与处理

MTT/CCK-8法：

试剂配制：

MTT：0.5 mg/mL（PBS溶解，避光保存）。

CCK-8：直接使用，无需稀释。

注意事项：

①试剂使用前平衡至室温（减少温度波动影响）。

②避光保存，避免反复冻融。

避坑指南：

▲勿将CCK-8直接接触金属（氧化失效）。

▲新批次试剂需与旧批次平行测试（误差<10%）。

3. 实验操作：孵育与检测

MTT法流程：

●加入MTT（10 μL/孔），37℃孵育4小时。

●吸弃培养基，加入DMSO（100 μL/孔）溶解甲臜。

酶标仪检测570 nm吸光度。

CCK-8法流程：

●加入CCK-8（10 μL/孔），孵育1-4小时。

●直接检测450 nm吸光度（无需溶解）。

避坑指南：

 避免孵育时间过长（CCK-8超过4小时易饱和）。

 使用多通道移液器减少孔间误差。

4. 数据采集与分析

数据处理公式：

细胞增殖率：

math\text{增殖率} = \frac{\text{实验组OD} - \text{空白孔OD}}{\text{对照组OD} - \text{空白孔OD}} \times 100\%  

数据标准化：Z-score法剔除异常值（阈值±2.5 SD）

避坑指南：

 ▲忽略空白对照（背景干扰导致数据虚高）。

▲ 每板设置阳性/阴性对照（验证试剂有效性）。

三、10大避坑技巧总结

▲细胞状态优先：使用活力>95%的细胞，死细胞比例每增5%，OD偏差升20%。

▲边缘效应控制：96孔板外围孔加PBS缓冲液，湿度维持>90%。

▲试剂批次验证：新批次MTT需与旧批次平行测试。

▲孵育时间精准：MTT严格4小时，CCK-8不超过4小时。

▲溶解步骤规范：DMSO分次吹打混匀，避免气泡。

▲设备校准：酶标仪每月用标准滤光片校准。

▲数据归一化：使用参考对照（如10% FBS组）校正批次差异。

▲避免血清干扰：检测前更换为无血清培养基。

▲操作同步：多通道移液器统一加样，缩短时间差。

▲异常值处理：Z-score法剔除±2.5 SD外的数据。
                                                                   四、常见问题与解决方案

五、进阶优化：提升实验效率

自动化方案：机械臂自动铺板（CV<5%）。

3D培养适配：使用CellTiter-Glo 3D试剂检测类器官。

AI辅助分析：深度学习自动识别EdU阳性细胞。

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