普拉特泽生物为广大生命科学研究人员提供动物实验，可根据实方案的要求选择不同的检测方法，本文就跟大家一起继续探究小鼠灌流及取脑实验 Protocol，新手也能轻松上手~·
在对脑组织进行切片和免疫染色或原位杂交等实验之前，为了排除血液对实验的干扰，通常会对小鼠心脏灌流后再进行解剖和切片。
实验前准备

1）灌流装置：50mL 注射器 + 输液管、灌流针头（23G 或 25G 静脉输液针，剪去针尖斜面保留钝头，避免刺破血管）。（或有的实验室可直接用注射泵）

2）手术器械：眼科剪（直 / 弯各 1 把）、眼科镊（直 / 弯各 1 把）、止血钳（2 把）、大头针、泡沫板、培养皿（6cm/10cm，用于盛放组织）。

3）其他：2个50ml离心管、PBS、4% 多聚甲醛（PFA）固定液<有毒注意安全>、塑料袋（装小鼠尸体）、手术巾、一次性手套口罩。

实验步骤

麻醉固定

1）麻醉：腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）：夹捏后肢无反应、呼吸平稳。（现在水合氯醛不符合动物伦理，不镇痛，按需换用其他麻醉方式：舒泰，各种牌子的肌松，戊巴比妥，三溴乙醇，异氟烷等）

2）固定：仰卧位固定于泡沫板上，用大头针固定四肢（前肢呈 “外八字”，后肢伸直），腹部朝上，用手术巾擦拭腹部及胸部毛发。

（附：腹腔注射）

1）抓取小鼠：

放在饲养笼上，提其尾巴中部，水平偏下往后轻拉，小鼠爪子会自然会抓住笼子，此时应该迅速抓住小鼠的颈背部的皮毛，最好是抓在小鼠的耳朵处，这样可以更好固定小鼠的头部，以防被咬。（但切记力气不要过大，容易使小鼠窒息）。

再将小鼠的尾巴用左手无名指或小拇指固定，这样就可以将小鼠整个躯干固定好，注意一定要让小鼠处于一个舒服的体位，如果小鼠躯干不能保持竖直，很容易扎到脏器，引起出血，影响实验。

2）注射：

抓取小鼠后，应腹部向上，头呈低位（使脏器移至低位，避免扎伤）。右手持注射器，插入小鼠腹部，注射部位为小鼠后肢根部连线处任一侧1.5cm处（建议从左侧进针，右侧重要器官比较多 避免扎入），缓慢以45度左右进针，进针深度小于1cm，进针的感受为局部皮肤凹陷消失和落空感，可回抽看是否有血液/尿液。

3）拔针：

为了防止漏液，轻微旋转针头，再缓缓拔出。

在实验前，准备酒精棉球，注射器在使用后要消毒才能给下一只小鼠使用，避免交叉感染。此外，注射前，也可以用酒精棉球擦拭小鼠皮肤，可以明显辨别药物是否注射到腹腔，如果看到鼓包，就是注射到皮下了。

暴露心脏与血管

1）剪开皮肤：用眼科剪从剑突下沿腹中线向上剪开皮肤（长度约 2cm），再向两侧横向剪开，暴露胸肌。

打开胸腔：用眼科剪沿肋骨两侧（避开心脏）向上剪开胸骨，打开胸腔，此时可见心脏（左心室呈粉红色，右心房呈暗红色）。

灌流操作

1）进针：左手持止血钳固定心脏，右手将灌流针头（提前连接输液管，排空气泡）从左心室心尖部（左心室最下端的尖状结构）斜向头端刺入（角度约 30°，深度 3-5mm）刺入后用止血钳将针头与心肌一起夹住固定（避免针头脱出）。

2）剪开右心耳：用眼科镊提起右心耳（右心房上方的暗红色小囊状结构），用眼科剪剪一小口（约 1mm），作为灌流液流出通道（放血口）。

3）PBS 冲洗（去血）：推注注射器，先灌注 0.01M PBS（37℃或室温，20g 小鼠用量 15-20mL，速度 5-10mL/min），先慢后快。观察指标：右心耳流出液从红色逐渐变清，肝脏由红变白，四肢轻微抽搐后停止，说明血液冲洗充分（约 3-5 分钟）。

4）PFA 固定：PBS 冲洗完成后，迅速切换至 4% PFA（4℃，用量与 PBS 相同，速度稍慢至 3-5mL/min）。观察指标：灌流时小鼠四肢逐渐僵硬，腹部鼓起，口鼻有少量固定液溢出，说明固定液已扩散至全身（约 5-8 分钟）（尾巴翘起说明灌流效果好）。

（步骤3）和4）也可用注射泵

5）终止灌流：PFA 灌流结束后，先拆开注射器输液管，再拔出针头，避免液体回流。

取脑组织

1）断头存放：从紧贴着耳朵后面的地方断头，迅速把头放进生理盐水的冰水混合物里，冷却30s。

2）开颅取脑：

从两耳之间剪皮至两眼之间，把鼠的头皮整个往上扒，横截面可见一个白点，是延髓；

从有延髓的孔把周围的骨头沿着上下左右的生长方向拔掉，可见小脑；

小脑上方可见四大片头盖骨，逐个向上掀开，可见完整大脑；

用弯镊从大脑最前端伸入大脑下方，拔断十二对脑神经和小脑神经连接，

即可取出。

3）标本后固定、脱水：

将游离出的全脑放入 4%多聚甲醛 PBS 中，放于 4°C 后固定（不超过 24 小时）。

PBS 清洗后脱水（30%的蔗糖溶液沉底）处理。
文源自粥小八
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好，小鼠灌流及取脑实验 Protocol就介绍到这里啦~

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