宝子们，做生物实验的一定对蛋白原核表达不陌生！今天噗啦噗啦实验室就来给大家奉上一份超全攻略，从核心原理到操作步骤，手把手带你玩转蛋白原核表达

一、原核表达核心原理

1.技术本质

通过基因工程手段，将目标基因插入表达载体后导入原核宿主细胞(如大肠杆菌)，利用细胞内的转录和翻译机制，实现外源蛋白质的高效合成。这一技术通过重组表达系统的构建，为蛋白质的生产、结构解析和功能研究提供了关键工具。

2.应用场景

①蛋白质表达技术在生物医学领域应用广泛:

②纯化制备:获取高纯度蛋白质，用于生物化学分析或结构生物学研究;

③亚细胞定位:揭示蛋白质在细胞内的分布规律，解析其功能机制;

④结构域分析:通过分段表达不同蛋白片段，研究结构与功能的对应关系;

⑤功能验证:为体外模拟蛋白质在生理或病理过程中的作用提供实验材料，助力疾病诊疗研究。

3.系统分类

→蛋白质表达系统主要分为原核与真核两大类，其中原核系统包括:

→大肠杆菌表达系统:最常用的原核平台，具有遗传背景清晰、表达效率高、培养周期短(仅需几小时)、抗污染能力强、技术成熟且成本低廉等优势，适用于大多数重组蛋白的表达;

→芽孢杆菌表达系统:分泌能力强，产物易于纯化，适合需要分泌表达的蛋白质;

→链霉菌表达系统:常用于抗生素相关酶的生产，利用其天然代谢特性合成特定功能蛋

4.大肠杆菌系统优势

大肠杆菌作为原核表达的首选宿主，具备以下核心优势:

基因组信息研究透彻，便于基因工程操作;

短时间内可大量合成目标蛋白，满足实验与生产需求;

培养条件简单(如 LB 培养基)，适合大规模放大培养;

实验技术标准化程度高，操作流程成熟易掌握;

菌株和质粒资源丰富，可根据蛋白特性灵活选择表达载体。

二、原核表达标准化操作流程

1.转化

将构建好的重组表达载体转入感受态 BL21/DE3菌株，常用热激法(42°C短暂处理)或电转化法，优化操作以确保高效转化，筛选出含有目标基因的阳性克隆。

2.扩大培养

在 500ml 灭菌 LB 培养基中加入对应抗性抗生素(终浓度 50-100ug/ml)，挑取单菌落接种后于 37°C摇床培养至菌液浓度达到诱导标准(通

常 OD₆₀₀为 0.6-0.8)

3.诱导过夜

取 100m 诱导前菌液(标记为 Pre-l)保存作为表达基线对照

剩余菌液中加入IPTG(终浓度 0.1-0.5mM)，18°C过夜诱导，促使目标基因表达。

4.菌体收集

诱导后的菌液经 4000rpm 离心 25 分钟，弃上清后，用 30-35mI Ni-A 缓冲液(适用于 His 标签蛋白)重悬菌体，转移至离心管备用。

5.超声裂解

冰浴条件下，用超声波破碎仪裂解菌体(功率200W，工作周期3秒开/3秒停，总时长9分钟，分3次操作)，随后通过 Bradford 法检测裂解液中的总蛋白浓度，验证裂解效果

6.离心分层

裂解液于 4°℃、4000rpm 离心 25 分钟，分离出上清液(SUP，含可溶性蛋白)和沉淀(PPT含包涵体或细胞碎片)，分别保留用于后续分析。

7.镍柱纯化

▲平衡:先用高浓度咪唑的 Ni-B 缓冲液(如400mM)冲洗镍柱去除杂质，再用低浓度咪唑的 Ni-A 缓冲液(如 20mM)平衡柱子;结合:将上清液与镍柱填料混合，4°C孵育1-1.5 小时，使 His 标签蛋白与镍离子充分结合;

▲洗杂与洗脱

过柱后收集穿流液(UB)，检测未结合的杂蛋白，评估结合效率;

用 Ni-A 缓冲液洗去杂蛋白(收集 WS样本)，再用 Ni-B缓冲液洗脱目的蛋白(收集E样本)，通过 Bradford 试剂监测至无杂蛋白释放。

8.变性与电泳将目的蛋白样本(E)、Pre-1、SUP、PPT.UB、WS 等分别加入 Loading Buffer，95°C变性 10 分钟，使蛋白完全解链，随后进行 SDS-PAGE 电泳(200V，40分钟)，分离不同分子量的蛋白条带

9.染色分析

电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液对凝胶染色通过微波炉辅助脱色(加热后摇床洗脱)，直至清晰显示蛋白条带，对比 Marker 判断目标蛋白的分子量和表达量。

三、关键样本类型与作用

在原核表达实验中，需收集多种样本以评估各环节效果:

Pre-l(诱导前菌液):诱导剂加入前的菌体样本，用于对比诱导前后的蛋白表达基线判断诱导是否有效;

Induced(诱导后菌液):加入IPTG后的菌体样本，验证外源蛋白是否成功表达及表达水平;

SUP(上清液):离心后的可溶性蛋白样本，反映目标蛋白是否以可溶形式存在于细胞中;

PPT(沉淀):离心后的包涵体或细胞碎片样本，提示目标蛋白是否形成不可溶的包涵体，需进一步复性处理;

UB(穿流液):镍柱纯化中未结合的液体，用于检测目标蛋白与镍柱的结合效率及杂蛋白残留量;

WS(洗杂液):洗去杂蛋白的流出液，监测纯化柱是否干净，杂蛋白去除是否彻底

E(洗脱液):最终收集的目的蛋白样本，用于验证纯化后的蛋白纯度和得率。

宝子们，蛋日原核表达虽然复杂，但掌握了这些要点实验就能顺利很多巴!快收藏起来，实验的时候拿出来参考~要是还有问题，随时交流呀：18570028002（微信同号）