Th17细胞简介

辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是一种新发现的能够分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。β转化生长因子(transforming growth factor b，TGF-β)、IL-6、IL-23和IL-21在Th17细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用，而γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)、IL-4、细胞因子信号传送阻抑蛋白3(suppressor of cytokinesignaling 3,Socs3)和IL-2则抑制它的分化。

Th17细胞是一类产生IL-17的Th细胞亚群，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关。大量研究表明，IL-17与实验性自身免疫性脑炎(EAE)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病明显相关。已有研究发现，被致病抗原髓鞘蛋白(PLP)致敏的CD4⁺T细胞经IL-23刺激后可产生大量的IL-17，将这些产生IL-17的细胞被动地转移给小鼠后可引发严重的EAE，给予抗IL-17中和性抗体可以部分抑制EAE的发生。Komiyama等在实验性自身免疫性脑炎的小鼠模型中，IL-17mRNA基因水平和蛋白质水平均升高。

大鼠外周血Th17细胞流式染色实例    

图1 大鼠外周血Th17细胞画门策略

Rat (Blood): IL-17A⁺ CD4⁺T cells

1. 标志物：Th17 cells (CD3+CD4+IL-17A⁺)；

2. 流式细胞仪：CytoFLEX，Beckman Coulter；

3. 流式抗体及用量： (PE anti-rat CD3，2.5μL/test, 201411，Biolegend),FITC anti-rat CD4 (0.5μL/test, 201505, Biolegend), APC anti-rat IL17 (0.625μL/test,17-7177-81, eBioscience)；

4. 分析软件：FlowJo V10；

5. 圈门策略及染色：见上图。

大鼠外周血淋巴细胞分离

• 血液准备：取2mL外周血加入2mL生理盐水，混匀；

• LymphoprepTM分离液（即用型）使用前平衡至室温，在15mL离心管底部加入3mL分离液，将第1步混好的血液小心铺在分离液上面，室温，800g离心25 min；

• 吸取白膜层细胞到新的15m离心管中，加入10mL左右的PBS或者培养基洗细胞一次，350g离心5 min。

  

图2 淋巴细胞分离流程图

细胞刺激及流式染色

• 含10%FBS的1640培养基稀释细胞密度到4x10⁶cells/mL，取500µL细胞悬液到24孔板中，每孔加入2µL的Cell Activation Cocktail (withBrefeldin A)，在37℃的CO₂培养箱培养4.5h；

• 流式染色实验步骤：准备流式上样管，并做好相应的标记。

• 收集体外刺激培养的细胞，350g离心5 min，用1mL的Cell Staining Buffer重悬细胞，350g离心5 min。

• 按照管设置分别加入相应的表面标记抗体，混匀后，室温避光孵育15-20 min。

• 加入至少2mL的细胞染色液洗1次，350g离心，5 min，弃上清。

• 加入Fixation Buffer (Cat# 420801)固定细胞，每管0.5mL固定液，室温避光孵育固定20 min。

• 350g，离心，5 min，弃上清。

• 用去离子水将10×的Permeabilization Wash Buffer (Cat# 421002) 稀释成1×的工作液。

• 用1mL 1×的Permeabilization Wash Buffer重悬固定的细胞，350g离心5-10 min，弃上清。

• 重复步骤两次。

• 用100µL Permeabilization Wash Buffer 重悬固定破膜后的细胞，加入特定的荧光标记抗体（抗体量根据说明书加），室温避光20 min。

• 用 2mL Permeabilization Wash Buffer洗细胞两遍。350g离心5 min，弃上清。

• 加入0.5mL的Cell Staining Buffer重悬细胞。