长沙的3月下了一场雨，一场雨下30天。小编感觉这个月都憋在室内，人都要长蘑菇了。既然天公不作美，那我们只能来看看文献打发时间了，今天给大家带来的是外泌体的高分文献，希望能对大家做高分文章提供一定思路。
《Essential roles of exosome and circRNA_101093 on ferroptosis desensitization in lung adenocarcinoma》2022年发布在Cancer Commun (Lond) 上，影响因子为15.283，像这种蹭热点（外泌体、铁死亡都是近5年的热点研究对象）的行为，还是很值得大家借鉴学习的，毕竟热度高说明感兴趣的人越多，杂志社为了下载量也会更多的去录用这类题材的文章。话不多说，开始学习吧~~
Fig 1 外泌体拮抗LUAD中的脂质过氧化和脱敏铁死亡
MDA是脂质过氧化的重要产物，与癌旁组织相比，LUAD中MDA水平确实较低（图1A）。此外，39.9%的LUAD样品显示脂质过氧化的另一个产物4-HNE表达下调（图1B）。然而，在筛选EGFR（Del19、L858R和T790M）、kRAS（G12C、G12S、G12A和G13C）和TP53（R196P、H179Y、P250L、R249S和R248G）中的常见突变后，我们发现MDA不太可能受到这些驱动突变的调控（图1C）。总的来说，脂质过氧化在大部分LUAD样本中被抑制，可能是通过驱动突变无关的方式。接下来测试外泌体是否抑制脂质过氧化并使LUAD细胞对铁死亡脱敏。治疗后的患者的体外原发性LUADs使用或不使用两种外泌体生物发生抑制剂GW4869和DMA治疗，它们的4- HNE均升高（图1D），表明抑制外泌体生成会刺激脂质过氧化。然后作者提取了健康个体和LUAD患者的血浆外泌体，并通过TEM进行了验证（图1E）。在将单层培养的H1975细胞与血浆外泌体预共孵育后，我们发现来自大部分LUAD患者的血浆外泌体可以显著防止erastin和 RSL3降低的细胞活力和诱导的细胞死亡以及脂质ROS的产生（图1F）。3D球体培养的结果也支持，只有LUAD血浆的外泌体能够防止H1975球体中LUAD和RSL3诱导的细胞死亡（图1G）。由于A549细胞和H1975细胞对铁死亡的敏感性存在差异，作者验证了A549细胞的外泌体是否介导H1975细胞对铁死亡敏感性的降低。如预期的那样，与A549细胞中提取的外泌体预共孵育使H1975细胞对erastin和RSL3的诱导脱敏（图1H）。然而，A549细胞经GW4869处理后共孵育的H1975细胞没有这些作用（图1H）。总之，外泌体在拮抗脂质过氧化和使LUAD细胞对铁死亡脱敏方面的作用被确认。
图一
Fig 2 在LUAD中，细胞内cir93的升高与外泌体cir93密切相关&肿瘤细胞分泌的外泌体对于增加LUAD细胞内cir93至关重要
接下来，研究外泌体中的重要成分。首先，作者在现有的circRNA ChIP数据分析了LUAD和正常肺样本之间circRNA表达的差异。在两个数据集中，cir93和cir34被鉴定为LUAD中常见的胞内环状RNA（图2A）。但在LUAD阵列中，只有cir93升高，而不是cir34升高（图2B和2C）。因此，作者在后续的实验中重点关注了cir93。值得注意的是，与健康个体相比，LUAD（n = 200）中也观察到血浆外泌体cir93升高（n = 200，图2D）。由于环状RNA通过外泌体在宿主和靶细胞之间转移，我们认为LUAD中细胞内cir93的升高与外泌体cir93密切相关。
在LUAD标本中测量cir93后发现68.0%（34/50）在肿瘤区域只表达cir93，而只有4.0%（2/50）在间质中表现出特异性的cir93表达（图2E）。对肿瘤区域单独表达的标本，使用α-SMA抗体进行IHC评估，α-SMA是成纤维细胞的生物标志物，在一定程度上能够区分间质和肿瘤区域，所有样本都显示了cir93和α-SMA相互排斥（图2F）。EpCAM是一种表面全癌抗原。通过对LUAD患者的原发肿瘤中患者来源的EpCAM（+）和EpCAM（-）细胞进行分类，作者发现cir93在EpCAM（+）细胞中的表达明显高于EpCAM（-）细胞（图2G）。综上所述，肿瘤区域更有可能负责在LUAD中建立外泌体和细胞内cir93之间的联系。随后，作者旨在研究肿瘤细胞自身分泌的外泌体是否会升高LUAD肿瘤区域的细胞内cir93。作者外泌体在EpCAM(+)细胞中的关键作用得到了进一步的验证，因为GW4869处理的第一个EpCAM(+)细胞的培养中外泌体减少，导致次级EpCAM(+)细胞内cir93无法维持（图2H）。研究发现只有EpCAM（+）细胞的外泌体可以提高EpCAM（+）细胞内cir93的能力，而EpCAM（-）细胞没有（图2I和2J）。细胞系与pkh67标记的外泌体孵育研究，进一步证实了外泌体介导A549和H1299细胞之间的cir93转移（图2K）。总之，肿瘤细胞自身分泌的外泌体对于LUAD肿瘤区域细胞内cir93的升高至关重要。为了进一步证实LUAD细胞在体内直接产生cir93并同时从外泌体获得cir93，作者分别从小鼠左侧和右侧单独表达mCherry(红色)或绿色荧光蛋白(GFP，绿色)标记的cir93的A549细胞中产生cdx(图2L)。在这两个位点的CDXs中都检测到越界信号(黄色)，GW4869阻断了越界信号(图2M)，表明LUAD细胞通过外泌体相互获取cir93。由于没有其他外源性的cir93来源，cir93的浓度明显降低(图2N)。我们的数据强烈表明LUAD细胞可以产生cir93并通过外泌体来维持cir93的表达。
图二
Figure 3 细胞内cir93的升高通过调节AA使LUAD细胞对铁死亡脱敏
铁死亡的特征是存在小于正常的线粒体，线粒体膜密度浓缩，用erastin和RSL3处理H1975细胞会产生这些效应；然而，过表达cir93可以阻止这些作用（图3A）。提高cir93可以阻断erastin和RSL3诱导的细胞死亡（图3B）。此外，与铁死亡抑制剂Fer-1和DFO类似，过表达cir93阻止了erastin和RSL3诱导的细胞活力降低和脂质ROS生成的增加（图3C）。因此，上述数据证明了cir93升高在体外减轻铁死亡作用。
接下来研究动物模型细胞内cir93的升高是否也能使LUAD细胞对铁死亡脱敏，结果显示与对照组相比，在肺内过表达cir93的LUAD小鼠中，PKE诱导的4-HNE和MDA的升高在很大程度上被阻止（图3D），这表明增强cir93的表达抑制了体内铁死亡相关的脂质过氧化。进一步研究抗cir93是否刺激小鼠LUAD质膜组分内的脂质过氧化。如图3E所示，使用抗cir93后，质膜内氧化的C11-BODIPY581/591（绿色）的比例显著增加。结合数据显示过表达cir93细胞对erastin和RSL3引起的铁死亡脱敏（图3A-C），作者认为增加细胞内cir93可能通过抑制脂质过氧化LUAD细胞铁死亡脱敏。PUFAs，如AA和AdA的过度过氧化，是激活铁死亡的先决条件。AA的质膜掺入也是这一过程的必要条件。在H1975细胞中，提高cir93降低了AA，但没有降低AdA与质膜的掺入（图3F和3G）。这些结果表明，cir93升高对脂质过氧化的抑制可能是通过其调节AA来介导的。最后，作者研究了外泌体是否以cir93依赖的方式抑制脂质过氧化。作者比较了MRC-5、WI- 38和A549细胞中提取的外泌体对erastin处理后的H1975细胞中脂质ROS生成的影响。发现只有来自A549细胞的外泌体显著降低了erastin诱导的脂质ROS生成（图3H），表明外泌体通过cir93依赖的机制抑制LUAD细胞的脂质过氧化。
图三
Figure 4 cir93上调FABP3&cir93-FABP3相互作用背后的分子基础及其在调节FABP3、AA、脂质过氧化和LUAD细胞对铁死亡的敏感性中的重要作用&外泌体通过LUAD中cir93上调FABP3
然后，进一步研究了cir93的下游效应因子，作者进行了蛋白质组学来识别受cir93影响的潜在蛋白。使用cir93、反义cir93和空白对照（无RNA）进行下拉实验，然后行蛋白质组学研究，鉴定出143个与cir93特异性相互作用的蛋白（图4A）。IB进一步证实cir93上调FABP3（图4B）。与cir93相似，FABP3不受erastin和RSL3的调控（图4C），这表明FABP3也是影响铁死亡的独立因素。此外，与WT H1975细胞相比，cir93在FABP3−/−细胞中无效（图4C）。研究结果表明，FABP3是cir93的下游靶点。此外，cir93通过上调FABP3的表达，使LUAD细胞对铁死亡脱敏。
作者通过在线软件catRAPID预测了FABP3和cir93相互作用的三个区域（图4D）。cir93下拉实验表明，cir93的R#2区域的缺失完全消除了H1975细胞中cir93-FABP3的相互作用（图4E）。使用抗myc抗体进行RIP实验，发现FABP3的P#3区域包含一个负责cir93- FABP3相互作用的关键结构域（图4F）。过表达FABP3减少了AA进入H1975细胞质膜，而没有减少AdA的掺入。然而，当P#4位点被删除时，就不再观察到这些影响。R#2区域的缺失也阻止了cir93抑制AA掺入的能力（图4G）。图4H的数据进一步证明了cir93-FABP3的相互作用是AA减少所必需的。随机选取30个LUAD组织标本，对FABP3的细胞内cir93和开放阅读框（ORF）进行测序。只有一个标本（3.3%）分别含有cir93的R#2和FABP3的P#4突变（图4I）。cir93和FABP3的突变增加了LUAD中的4-HNE浓度（图4J），进一步证实了cir93-FABP3相互作用在降低脂质过氧化作用中的重要性。此外，cir93-FABP3相互作用紊乱会破坏cir93和FABP3使H1975细胞对erastin-和RSL3诱导的细胞铁死亡脱敏的能力（图4K）。综上所述，cir93-FABP3的相互作用对调节AA、降低脂质过氧化和LUAD细胞对铁死亡的敏感性至关重要。为了研究LUAD细胞的血浆外泌体是否通过cir93-FABP3相互作用上调细胞内FABP3的表达。将来自LUAD (n = 200)细胞的血浆外泌体与表达WT FABP3或不含p# 4区FABP3的H1975细胞共孵育。在表达WT FABP3的H1975细胞中，68.5%的(137/200)外泌体将FABP3表达上调了两倍以上，而在不含p# 4区FABP3的细胞中，只有3.5%的(7/200)外泌体表现出类似的功能(图4L和4M)，这表明在LUAD中，外泌体也需要cir93-FABP3相互作用来上调FABP3。
图四
Fig 5 牛磺酸对于cir93-FABP3调节AA和使LUAD细胞对铁死亡脱敏至关重要
代谢组学分析比较高水平和低水平FABP3的LUAD组织中的代谢物。在362种代谢物中（n=30，图5A）牛磺酸是唯一能与AA反应产生NAT的代谢物。牛磺酸和AA是底物，而NAT是该反应的产物（图5B）。与FABP3 WT相比，过表达FABP3 F16S并不能减少牛磺酸（图5C）。这些结果表明，FABP3的上调刺激了AA的转运及其随后与牛磺酸的反应，从而降低了LUAD细胞中的整体AA。在H1975细胞中过表达cir93导致牛磺酸和整体AA的降低，但在敲除FABP3后，过表达cir93产生的影响完全消失（图5D和5E），表明cir93通过FABP3调控牛磺酸和整体AA。在A549细胞中通过抑制cir93，会诱导牛磺酸和整体AA水平（图5F和5G）。此外，与健康个体的外泌体相比，H1975细胞与LUAD患者的血浆外泌体共孵育也导致牛磺酸和整体AA水平较低（图5H和5I）。考虑到AA在铁死亡中的重要性，外泌体诱导的LUAD细胞对铁死亡的脱敏可能部分是通过cir93-FABP3-牛磺酸依赖的方式减少整体AA来介导的。CDO1和CSAD对牛磺酸的合成至关重要（图5J）。通过同时敲除H1975细胞中的CDO1和CSAD，牛磺酸显著降低，但过表达cir93或FABP3不能进一步降低（图5K），表明足够的牛磺酸是cir93和FABP3调节牛磺酸本身的先决条件，牛磺酸确实是cir93和FABP3降低整体AA的关键（图5L）。牛磺酸消耗后，erastin-和RSL3诱导的铁死亡和脂质ROS生成在基础水平上显著加重；然而，cir93和FABP3介导的恢复作用均被抑制（图5M），表明牛磺酸是抗铁死亡因子，是cir93和FABP3使LUAD细胞对铁死亡脱敏的必要条件。通过评估植入小鼠的LUAD细胞中氧化的C11-BODIPY581/591组分和MDA浓度，进一步验证了体内PKE给药后牛磺酸在cir93和FABP3介导的脂质过氧化减少中起重要作用（图5N和5O）。
图五
在过量的外源烷基标记AA的存在下进行了点击化学，过表达cir93和FABP3仍然阻止AA进入质膜(图6A, 6B)，表明可能同时涉及另一种机制。由于AA的消耗伴随着NAT的产生(图5B)，我们推测新生的NAT可能对cir93和FABP3的功能至关重要。
正如预期的那样，在H1975细胞中建立了cir93、FABP3和NAT之间的关系(图6C和6D)。此外，牛磺酸对于cir93和FABP3在H1975细胞和植入肿瘤中升高NAT是必不可少的(图6E)。有趣的是，与健康个体的血浆外泌体相比，与LUAD患者的外泌体共孵育导致H1975细胞内NAT水平更高(图6F)，进一步表明NAT升高是外泌体使LUAD细胞脱敏的关键事件。为了提供NAT阻止AA掺入质膜的直接证据，作者将NAT直接与H1975细胞孵育，并证实了NAT的功能(图6G和6H)，并发现在NAT的存在下，erastin和RSL3诱导的细胞死亡、脂质过氧化和细胞活力的降低得到了缓解(图6I和6J)。因此，cir93和FABP3诱导的LUAD细胞对铁死亡脱敏，也可能是通过刺激NAT的产生来阻止AA掺入质膜所导致的。众所周知，ACSL4、LPCAT3和PLTP是参与AA掺入质膜的酶（图6K）。并观察到在H1975细胞中，它们都被NAT剂量依赖性地降低（图6L）。通过比较ACSL4、LPCAT3和PTLP在与血浆外泌体共孵育时的倍数变化，作者发现LUAD患者中有78%（78/100）、67%（67/100）和70%（70/100）的外泌体降低了ACSL4、LPCAT3和PTLP。然而，仅在来自健康个体的12%（12/100）、12%（12/100）和15%（15/15/100）的外泌体中也发现了类似的效果（图6M和6N)。总之，NAT介导的与AA掺入质膜相关的酶的下调，对于外泌体、cir93和FABP3使LUAD细胞对铁死亡脱敏同样重要。此外，作者还验证了NAT通过TLX2依赖的机制抑制了ACSL4、LPCAT3和PLTP的蛋白和mRNA的表达(图6O）并且NAT能够从启动子中取代TLX2（图6P和6Q）。
图六
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我们下个月不见不散~
2023-04-04 10:50:01
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