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CHIP实验结果总是不理想?看看这个【新手入门】

2020-12-11 15:00:37

来源/作者:普拉特泽生物-医学整体课题外包

今天我们讲:如何做好ChIP


染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是研究体内(划重点鸭,体内)蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。可应用于组蛋白修饰、DNA复制与损伤相关因子结合分析、干细胞调控转录因子及辅因子等基因表达机制的广泛研究。


最近有做CHIP的朋友来找我们咨询:


“为什么我的ChIP实验做出来,

结果就是不理想呢?”

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我们经过不断的尝试,总结了一些小小经验,分享给大家,希望能对各位做ChIP的朋友们有所帮助。


为得到理想的ChIP结果,可以做以下实验条件优化


1、 染色质的制备:为了获得足量的染色质,我们的样品准备一定要充足。(IP实验的损耗较大,为保证实验用量,一次准备5×10E7个以上细胞较好)


2、 优化交联固定条件:ChIP实验成功与否,直接取决于染色质完整性、抗原表位质量和抗体特异性(抗体一定买好的)。因此优化交联固定条件,富集丰度更高。


3、 优化染色质片段化条件:要得到理想的ChIP结果,合适长度和浓度的染色质样品至关重要。(推荐的片段化程度为的染色质片段在150-900bp之间)。


4、 免疫沉淀优化:在ChIP抗体富集优化实验中,使用过多或过少抗体对ChIP结果都有负面影响


5、 蛋白酶K解交联和DNA纯化。


另外,小编也为大家列举一些疑难杂症及拯救方法:


疑难杂症1:消化的染色质浓度过低

拯救方法:

①如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg然后继续实验。

②在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量,在声波处理前后在显微镜下观察胞核,以证实胞核完全裂解。


疑难杂症2:染色质消化不足且片段过大(大于 900 bp)

拯救方法:

①确定甲醛浓度,将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

②在交联之前计算平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量

③适当延长染色质消化时间。


疑难杂症3:样品输入对照组 PCR 反应中无产物

拯救方法:

①向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

②优化实验引物的 PCR 条件或设计小于 150 碱基对的引物扩增。

③为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。


依照惯例,搬上我们的优秀案例


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结合此结果图,阳性对照组条带清晰无杂带,阴性对照组正常,表明ChIP实验结果可信,操作合格。Input对照组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用于该指标的检测。实验组均有目的条带,表明ST6GALNAC6和某抗体可发生结合。