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入门级!6种常见报告基因介绍——GFP、hGH和SEAP

2021-02-23 09:31:54

来源/作者:普拉特泽生物-医学整体课题外包

在学习开始之前,首先,对于报告基因我们了解多少呢?


报告基因(reporter gene)是指其表达产物易被检测,且易与内源性背景蛋白相区别的基因。


报告基因技术是通过把已确定的顺式调控序列剪接到报告基因上来控制基因的活性,这些反应元件可以对宿主细胞中基因调控和表达的变化起反应,从而就可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。


报告基因的优点:
细胞内背景活性低,并且可以将细胞表面的信号放大,产生一个高敏感、易检测的反应。


报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连,先让质粒在大肠杆菌中进行增殖,再提取质粒,转染入感兴趣的真核细胞中。其选择依赖于所使用的细胞系和实验的性质,以及对相应检测方法的可行性。


作为报告基因必须具备以下特点:

1、由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别;

2、细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测;

3、报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。


报告基因的种类很多,根据对其表达产物的分析检测方法的不同,可将其分为体外报告基因和体内报告基因。

前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液(分泌型报告基因)中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、人生长激素基因(hGH)及分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)等。

后者的分析可以在活的细胞或组织中,或在已经组化固定的组织或细胞中进行。较典型的如绿色荧光蛋白基因(GFP)。而β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)和萤火虫荧光素酶基因既可以在体外分析也可以在体内分析。

我们先来简单了解一下绿色荧光蛋白基因。

已知的绿色荧光蛋白是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白,也是目前应用最多的发光蛋白,简称GFP。

因此,GFP可作为报告基因用于检测基因表达或调控,或作为融合标签来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用,或靶向标记某些细胞器。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发,GFP可在508nm处自行发射绿色荧光,无需辅助因子和底物。

GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。

1991年克隆了GFP基因,已获得几个突变体,如“红色迁移”突变体(red—shiftmutant),其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilized EGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp.)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed),可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用,同时检测2个甚至3个基因的表达。

报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选,尤其适用于基因转移的定性研究。


常用载体:

入门级!6种常见报告基因介绍——GFP、hGH和SEAP


入门级!6种常见报告基因介绍——GFP、hGH和SEAP


人生长激素基因(hGH):是由人脑垂体前叶分泌的一种多肽,属于分泌型报告分子,可直接检测蛋白水平,可以在96孔板内进行高通量分析,操作简单。


检测方法:

人生长激素ELISA试剂盒


分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP):是人胎盘碱性磷酸酶的突变体,无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞,只用培养介质即可检测酶活性,便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性,操作简单,反应时间短,价格廉价,但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定,其灵敏度增高。SEAP可催化D-荧光素-O-磷酸盐水解生成D-荧光素,后者又可作为荧光素酶的底物,此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高,接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。


检测步骤:

入门级!6种常见报告基因介绍——GFP、hGH和SEAP


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关于其中3种报告基因的介绍就到这里,剩下的内容我们下期见。