大家好，今天普拉特泽生物跟大家一起看的是DNA pulldown实验操作步骤。DNA pull down是研究DNA和蛋白质互做关系的非常重要的实验，实验步骤由普拉特泽生物分析检测平台技术总结分享，欢迎科研实验人员联系互相交流。

        1．探针设计及标记

        ①　采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；

        ②　将其克隆至pMD-18T克隆载体，并测序鉴定成功；

        ③　使用PCR法或末端标记法标记探针；

        ④　标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；

        ⑤　-20℃保存，待用；

        2．Pull down

        ①　预先混合 5 µg 生物素标记的 DNA 和 500 µg 核蛋白，置于冰上；

        ②　取 100μL Streptavidin-agaroseG 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 离心 30 秒；

        ③　将 DNA 与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子；

        ④　4℃孵育 1 小时；

        ⑤　5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；

        ⑥　用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；

        ⑦　 加入 30 μL 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，

        3．蛋白质检测-- Western Blot

        ①　电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60 ug总蛋白，开始电压为100 v,到达分离胶后调为120 v；

        ②　转膜：转膜为恒流转膜，电流为200 mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120 min。

        ③　封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。

        ④　孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。

        ⑤　孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。

        ⑥　显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。

        4．蛋白质检测-- MS

        ①　切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2 mm），置于1.5mL EP管中。

        ②　清洗：用200 uL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。

        ③　脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200uL，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。

        ④　脱水：加ACN 100 μL脱水至胶粒变白，吸弃ACN。

        ⑤　清洗：用200 μL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200uL 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。

        ⑥　脱水：加ACN 100 μL 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。

        ⑦　用25 mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30 min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃过夜(16h)。

        ⑧　质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；

        ⑨　离子源加速电压1为24kv；

        ⑩　加速电压2为22kv；

        11　离子延迟提取0.000ns；

        12　真空度1.4×10-7 Torr；

        13　质谱信号单次扫描累加200次；

        14　使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；

        15　样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；

        16　利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。

        OK，那DNA pull-down实验的详细操作步骤我们就分享你到这里啦，如果您还有什么问题的可以直接留言，有需要DNA pull-down实验外包或代做的老师也可以直接留言需求，技术会第一时间给到回复的！