免疫荧光常见问题与处理方法由普拉特泽生物——病理实验平台总结分享，文末附上免疫荧光实操视频供大家学习。本文根据我们承接的各类样本免疫荧光实验与技术咨询总结而来，欢迎大家补充完善。

         免疫荧光常见问题一：目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果

              这种情况出现后，首先要检查一下抗体对不对，是否适用于你的预处理组织。有些抗体只适用于冰冻切片，但若将其应用于石蜡切片，就会造成弱标记或无标记现象，然后通过文献等查找一下目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何。此外，如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。比如，尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复，但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复，建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

         免疫荧光常见问题二：目标蛋白的荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果

               这种情况一般出现在抗体浓度过高而漂洗又不充分的时候。多余的抗体会吸附在组织上，造成荧光图像整体高背景。

               解决方法是适当降低一抗或者二抗的浓度，增加漂洗时间，一般能够有所改善。

          免疫荧光常见问题三：DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色

               防荧光衰减的DAPI试剂，使用时滴上一滴就能将细胞核标记，但滴加的量太多时，会造成整张图像呈现出蓝色的背景。因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆盖上薄薄的一层即可。

           免疫荧光常见问题四：组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色

               如果组织切片，尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻底，也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻底，脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。

               实验过程中，玻片干燥了，同样会造成高背景或大面积的非特异性标记。漂洗环节和抗体孵育环节最容易出现干片现象，尤其是大批量实验时，一定要注意。使用免疫组化专用笔画个圈，可以有效改善。

           免疫荧光常见问题五：采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析

               采集图像时不要对每一张图像都加上标尺，否则后期采用Image J或者IPP进行分析时，这些标尺会对结果造成影响。采集图像时，速度要快。如果激发光很长时间对准目标区域，此区域内的荧光衰减会极快，有经验的人都知道，不必多说。因此，目标区域较小时，一定要尽量快速采集，减少人为实验误差。

        以上就是我们总结的关于免疫荧光实验的常见问题及其处理的方法，免疫荧光视频请点击《免疫荧光/IF染色 理论+实操》，有免疫荧代做需求的老师可直接留言，我们会马上与您取得联系~