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细胞/组织免疫荧光实验操作步骤【附视频教程】

2022-06-29 15:14:19

来源/作者:普拉特泽-病理染色技术平台

        大家好!今天普拉特泽生物病理技术分享的就是免疫荧光/IF染色实验的操作步骤!上期给初次接触到免疫荧光的小白们简单介绍了一下免疫荧光技术,忘记回去复习哦。普拉特泽生物承接的免疫荧光代做实验主要是细胞与组织样本,我们总结出来一套高效专业的实验步骤,文末附上免疫荧光理论实操视频教程,欢迎大家学习指正!


        以某细胞样本为例:

        一、准备免疫荧光所需的仪器与试剂:

        CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、离心机、超净工作台、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、抗生素

        二、细胞免疫荧光技术操作

        1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用生理盐水浸洗3次;

        2.4%的多聚甲醛固定爬片15 min,生理盐水浸洗玻片3次;

        3.0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);

        4.生理盐水浸洗玻片3次,吸干生理盐水;

        5.每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗,4℃孵育过夜;

        6.加荧光二抗:生理盐水浸洗爬片3次,每次3 min,吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中37℃孵育1h,生理盐水浸洗3次。注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量避光操作;

        7.复染核:滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行染核,生理盐水4次洗去多余的DAPI

        8.在荧光显微镜下观察采集图像。


        以某组织样本为例:

        一、准备免疫荧光所需的仪器与试剂:

        生化培养箱、微波炉、生物组织摊烤片机、普通冰箱、盖玻片、载玻片、无水乙醇、3%双氧水、中性树胶、二甲苯、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液

        二、组织免疫荧光技术操作

        1.60℃烤片30 min

        2.切片脱蜡至水:先将切片置于二甲苯中10 min2次。然后依次在100%95%85%75%乙醇,每级放置5-10 min。再用蒸馏水浸洗5 min

        3.热修复抗原:将切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0,微波炉高火加热8 min后拿出,冷却至室温。冷却后PBSpH7.2~7.6)洗涤3 min x 3次;

        4.加入3% H2O2,室温10分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次;

        5.血清封闭:切片滴加血清放入湿盒中,室温20 min。甩干不洗;

        6.孵育一抗:滴加适当稀释的一抗,对照组滴加等量PBS4℃冰箱过夜;

        7.加荧光二抗:PBS浸洗3次,每次3 min,吸干切片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中37℃孵育1hPBS浸洗3次;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量避光操作;

        8.复染核:滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行染核,PBS 4次洗去多余的DAPI

        9.封片:防荧光淬灭封片剂封片、荧光显微镜观察。

        好了,到这了,细胞样本与组织样本的免疫荧光操作就总结到这里啦!想学习免疫荧光技术操作的同学建议全文背诵哦,深入视频学习请点击:IF/免疫荧光》,有需要免疫荧光代做、外包的老师欢迎留言呀~