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Western blot检测_蛋白质免疫印迹实验注意事项—新手必看超全

2022-02-28 15:34:03

来源/作者:普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

   Western Blot(蛋白质免疫印迹)实验操作注意事项由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》总结分享,根据成百上千例Western Blot检测经验汇总,从蛋白样本制备、凝胶配制、电泳、转膜、封闭、抗体杂交等方面详细讲解WB检测过程中常见容易忽略的操作错误与注意事项,新手必看。普拉特泽更提供线下WB检测培训及分子生物学实验各项外包服务。

   WB实验作为分子生物学中最为常见的实验,却蕴含了很多技巧与知识,看到别人WB检测结果那么漂亮,你连蛋白样本都制不出来是不是特别的羡慕嫉妒恨呢。不用担心,普拉特泽在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少实验操作经验,为大家提供线上WB操作视频培训,线下实操一对一带教,是您提升实验操作技能的好老师哦。老话说,前人种树、后人乘凉,现在我们就来看看,WB实验过程中有哪些需要我们关注的操作注意事项吧!

   一、WB检测——蛋白样本制备注意事项

   1、蛋白质的样品制备是Western Blot的第一步,根据普拉特泽上万例蛋白质免疫印迹检测经验,WB待测组织净重与裂解液的体积比例为1g:10ML。同时,要想获得所有蛋白质,还应注意以下问题:

   (1)在合适的条件下,保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

   (2)选择合适的表面活性剂和还原剂,使其形成各自多肽的溶液。

   (3)尽量去除核酸、多糖、脂类等分子的干扰,裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。

   (4)整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行,避免细胞破碎释放出各种酶类,但是注意不要反复冻融哦。


   二、WB检测——凝胶的配制注意事项

   制胶关键是聚合时间,分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶,时间为1020分钟(未完全凝聚),浓缩胶最佳聚合时间为8-10 min,可通过控制APTEMED量来控制。具体的实验操作方法与凝胶配方可以观看春风学院western blot 理论+实操》参观学习哦。

   三、WB检测——电泳注意事项

   (1)应待凝胶充分凝固后电泳,或者催化剂加入后充分混匀,否则条带容易中间凹陷两边翘起。

   (2)两板玻璃之间排除所有的气泡,防止条带中间鼓两边下陷。

   (3)加样前离心,选择适当的样本缓冲液,加适量的样品促溶剂,防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。

   四、WB检测——转膜注意事项

   (1)要使Western Blot蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上,缓冲液的PH值很重要。分子量不是很大的蛋白质区带要适当改变转移缓冲液的pH,而分子量较小的蛋白质,可以在缓冲液中加入适量甲醇促进它们固定在固相膜上(大分子量的蛋白质不适合加甲醇)。

   (2)电转印膜常用的NC膜使用的最为普谝,它的蛋白质容量大,可用各种染色方法进行检测,但是它与蛋白质的结合是非价性的,膜干燥后很脆。操作过程中要注意。


   五、WB检测——封闭注意事项

   (1)蛋白质免疫印迹电泳转膜过后,为防止与一抗或二抗非特异性结合,膜上其他没有结合蛋白质的空白位詈需要用封闭液加以封闭。

   (2)封闭液中加入适量的防腐剂,避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

   六、Western Blot——抗体杂交注意事项

   (1)适当降低抗体的浓度,增加洗膜次数防止非特异性条带过多。

   2优化转移时间和电流,增加抗体的浓度,适当延长曝光时间,防止信号弱、可能转膜不完全。

   Western Blot实验操作每一步的注意事项小编就总结到这里啦,是不是对新手友好很全面避雷呢?想学习完整的WB(蛋白质免疫印迹)实验步骤的小伙伴可点此跳转学习哦:Western blot最全实验操作步骤。

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