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GUS染色实验原理与步骤

2022-01-20 15:21:38

来源/作者:普拉特泽-病理染色技术平台

一、GUS染色实验目的与原理

GUS染色的实验目的是对植物样本进行染色,因为绝大多数植物细胞内不存在内源GUS活性,因此GUS基因广泛用作转基因植物的报告基因。

GUS(β-glucuronidase,β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因,其表达产物β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶,能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解,它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide,缩写为X-Gluc)分解为蓝色物质。

 

二、GUS染色实验方法

(1)组织化学染色定位方法

(2)荧光法测定GUS活性

(3)分光光度法测定GUS活性

 

三、GUS染色实验步骤

以某植物样本为例:

step1: 90%丙酮固定20 min;

(丙酮(acetoue)渗透力很强,能使蛋白质沉淀凝固,但不影响蛋白质的功能基团而保存蛋白质的活性,用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好,因此可用于GUS染色前的固定,可防止GUS信号的扩散。特点是固定快、渗透力强,易使组织细胞收缩;但保持细胞结构的能力欠佳。固定方法:一般4℃下20分钟为宜。)

Step2 : 1 mL GUS洗液洗去丙酮,洗2遍:

Step3 : GUS染色液,冰上抽真空15-20 min;

Step4 : 37°C放置,隔一阵观察一下,染上色了就进行下面步骤

Step5 : 吸出染色液,加入1 mL 70%乙醇,停止染色反应及脱色

Step6 : 更换几次乙醇直到脱色完全

Step7 : 解剖镜及显微镜拍照观察

载玻片上加适量HCG透明液,用镊子取出幼苗在透明液中铺平,盖上盖玻片,解剖镜观察整株,显微镜观察细节并拍照。