对于生信的小伙伴来说，Western Blot是最常用的蛋白定量表征手段之一。WB不仅用于判断蛋白是否表达，更重要的是用于半定量比较不同样品中目标蛋白的相对含量变化。通过对条带灰度值的测量，并结合内参蛋白进行归一化处理，可以实现对蛋白表达水平的可靠比较。

本期普拉特泽生物来分享如何使用Image J对WB进行蛋白定量并用Graphpad美图全过程。

1.打开Image J软件，跳出弹窗，如下图所示；

2.点击File—Open—选择打开目标WB蛋白条带；

3.依次点击Image—Type—8bit；

4.去除背景影响，点击Process—Subtract Background，在跳转出的对话框，在Rolling ball radius 选择50pixels；

5.设置参数，点击Analyze—Set Measurements—选择参数Area、Min& max gray value、Integrated density和Mean gray value；

 6.接着点击矩形，勾选出条带部分；

7.点击Analyze—Gels—Select First Lane；接着再点击Analyze—Gels—Plot Lanes；

8.在跳出的对话框，点击直线，按住shift键，依次对各个峰进行绘制封闭；

9.点击魔法棒工具，依次点击各个峰，会跳出的各个峰的面积，即为WB各个蛋白条带的面积；按照上述步骤，重复平行操作3次。

10.复制值到Excel中，对所有值进行内参归一化。

11.打开Graphpad软件，选择Column，点击create；

12.将数据导入到软件中，点击Analyze—选择One-way ANOVA，点击ok；

13.点击绘图，选择Individual values，选择带数据点的柱形图；

14.接着对图形进行美化，其中包括颜色、图形边框、字体、坐标轴等，其最终效果图如下图所示：

ImageJ的WB定量，本质是：在相同ROI下提取条带积分灰度→扣背景→用内参归一化→转换为可统计的表达量变化→使用绘图软件绘图。大家学会了吗？