WB 转膜后怕白做？3 种快速判断蛋白转印的方法

Question：WB 转膜后怕白做？3 种快速判断蛋白转印的方法，10 秒就能出结果？（普拉特泽生物提供长期稳定的wb实验外包服务）

在Western Blot（WB）转膜后，快速判断蛋白是否成功转印到膜上，可通过预染 Marker 验证、膜染色、快速检测试剂盒等方法实现，操作便捷且结果直观。

最常用：利用预染蛋白Marker（Pre-stained Protein Marker）

这是实验室最常规、无需额外操作的快速判断方法，几乎每个WB 实验都会用到，核心是通过预染 Marker 的迁移情况验证转膜效率。

原理

预染Marker 在制胶时已加入染料（如蓝色、红色荧光染料），电泳时随蛋白一起迁移，转膜过程中会与样本蛋白同步转移到膜上。若膜上能观察到清晰的预染 Marker 条带，说明转膜系统（电极、缓冲液、膜 / 滤纸贴合度）正常，蛋白已成功从胶转移到膜上。

操作步骤

转膜前：将预染Marker 加在凝胶的其中一个泳道（通常是最左侧 / 右侧），与样本蛋白一同进行 SDS-PAGE 电泳。

转膜后：无需任何处理，直接将转印后的膜放在白色背景板（如滤纸、培养皿盖）上，用肉眼或手机拍照观察。

判断标准：若膜上出现与预染Marker 说明书一致的、清晰的条带（无模糊、无拖尾、无明显缺失），说明转膜成功，且转膜效率良好；若膜上无Marker 条带，或条带仅在凝胶上残留（可将转膜后的凝胶用考马斯亮蓝快速染色验证），说明转膜失败（可能是电极接反、膜未激活、缓冲液失效等）。

优势

零额外步骤：无需染色、孵育，转膜后直接观察；

快速：10 秒内可判断，不耽误后续封闭、孵育流程；

同时验证转膜方向：若Marker 条带顺序与电泳时一致（小分子在下、大分子在上），可排除 “膜与胶贴反” 的失误。

直接验证总蛋白：丽春红S（Ponceau S）染色

若需确认样本总蛋白是否转印到膜上（而非仅依赖Marker），可使用丽春红 S 快速染色，该方法可逆，不影响后续抗体孵育。

原理

丽春红S 是一种酸性染料，可与蛋白中的碱性氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）结合，形成红色条带，且染色后可被水或 TBS 洗去，不干扰后续 WB 检测。

操作步骤

转膜结束后，取出膜，用去离子水或TBS 缓冲液快速冲洗 1-2 次（去除残留转膜缓冲液）；

将膜浸泡在0.1% 丽春红 S 染液（溶剂：5% 醋酸水溶液）中，室温轻摇染色 1-3 分钟；

取出膜，用去离子水或TBS 缓慢冲洗 2-3 次（每次 10-20 秒），直至背景变浅、蛋白条带清晰；

观察结果：将膜放在白色背景上，若能看到与样本泳道对应的红色条带（条带清晰度与样本上样量相关，上样量越高越明显），说明总蛋白已成功转印；若无条带，需排查转膜问题。

后续处理：确认后，用TBS 继续冲洗膜 2-3 次，直至红色完全褪去，即可进入封闭步骤（封闭液也会加速染料褪去）。

优势

直接反映总蛋白转印情况：避免“Marker 转印成功但样本蛋白未转印” 的特殊情况（如样本蛋白未从胶中迁出）；

可逆、无干扰：不影响后续抗体结合，无需额外处理；

成本低：染液易配制，可重复使用2-3 次。

注意事项

染色时间不宜过长：超过5 分钟可能导致背景过深，条带模糊；

冲洗需温和：避免用力揉搓膜，防止蛋白脱落；

不适用于PVDF 膜长期保存：丽春红 S 染色后若不及时冲洗，可能导致膜变脆。

快速验证目标蛋白：快速Western 检测试剂盒

若需直接确认目标蛋白是否转印成功（而非总蛋白），可使用商业化的“快速 Western 检测试剂盒”，适合紧急验证或少量样本检测。

原理

这类试剂盒通常包含“荧光标记的二抗 + 快速孵育缓冲液”，无需封闭步骤，可在 10-15 分钟内完成目标蛋白的检测，本质是简化版的 WB 孵育流程，通过目标条带的出现判断转印成功。

操作步骤

转膜后，用试剂盒配套的“快速缓冲液” 冲洗膜 1 次（替代封闭）；

将膜浸泡在“目标蛋白一抗 + 快速缓冲液” 混合液中，室温轻摇孵育 5-8 分钟（一抗已预稀释，无需额外稀释）；

用快速缓冲液冲洗膜2 次（每次 1 分钟），去除未结合一抗；

将膜浸泡在“荧光二抗 + 快速缓冲液” 混合液中，室温轻摇孵育 3-5 分钟；

用快速缓冲液冲洗膜2 次，然后用荧光成像仪检测；

若出现与目标蛋白分子量一致的荧光条带，说明目标蛋白已成功转印；若无条带，需结合Marker 和丽春红染色排查是转膜问题还是抗体问题。

优势

直接验证目标蛋白：跳过总蛋白染色，直接确认目标蛋白转印情况；

快速：全程15-20 分钟，远快于常规 WB（需数小时）；

特异性高：仅结合目标蛋白，避免总蛋白染色的非特异性干扰。

局限性

成本较高：试剂盒价格高于丽春红染液；

需提前准备目标蛋白一抗：需与试剂盒兼容的一抗（通常为兔源或鼠源）。

其他辅助判断方法（排除操作失误）

检查转膜装置：确认电极未接反（通常“胶侧接负极，膜侧接正极”，蛋白带负电向正极迁移）；若接反，蛋白会迁移到滤纸上而非膜上；

膜的激活状态：PVDF 膜需用甲醇浸泡 10-30 秒激活（打开膜的疏水通道，便于蛋白结合），若未激活，蛋白无法附着在膜上；硝酸纤维素膜（NC 膜）无需甲醇激活，若用甲醇处理反而会导致膜溶解；

凝胶残留检测：转膜后，将凝胶用考马斯亮蓝快速染色液（0.25% 考马斯亮蓝 R-250，溶剂：40% 甲醇 + 10% 醋酸）染色 5-10 分钟，脱色后若凝胶上无明显蛋白条带（或条带极浅），说明蛋白已大部分转移到膜上；若凝胶上仍有清晰条带，说明转膜效率低（需延长转膜时间、提高转膜电流等）。

总结

WB 转膜后可通过多种方法快速判断蛋白转印情况：预染 Marker 最常用，转膜后直接观察膜上条带，10 秒内出结果；丽春红 S 染色能验证总蛋白，染色后冲洗可逆，不影响后续实验；快速 Western 试剂盒可直接确认目标蛋白，15-20 分钟完成检测。还能通过检查装置、膜激活状态及凝胶残留辅助排查问题，可按需选择方法。
图源自生物奇迹
如侵则删

好，今天快速判断蛋白转印的方法

就说到这里

觉得有用欢迎转发收藏