很多人WB结果不好，却没怀疑过自己的胶选错了

Question：很多人WB结果不好，却没怀疑过自己的胶选错了（普拉特泽生物提供长期稳定的wb实验外包服务）

一、凝胶浓度对蛋白有哪些影响呢❓

把聚丙烯酰胺凝胶想象成一个分子筛网：

1）高浓度胶（如15%）：网眼小，小蛋白能灵活穿梭，大蛋白则寸步难行

2）低浓度胶（如8%）：网眼大，大蛋白可以自由奔驰，小蛋白却可能“刹不住车”

选错浓度会怎样？

1）胶太浓：大蛋白分离不开，挤成一团

2）胶太稀：小蛋白跑得太快，直接“跑丢”

二、到底应该怎么选择浓度胶呢❓

浓度胶选择技巧：

1）不确定时选10%：适合大多数常见蛋白（这也是我们常用的浓度胶）

2）大蛋白用低浓度：更容易分离且转膜更充分

3）梯度胶是神器：从上到下浓度递增，一块胶搞定不同大小蛋白

特殊分离胶浓度需要考量：

1）应对超大或超小分子量蛋白

对于大于200 kDa的蛋白，比如200 kDa或280 kDa的蛋白，推荐使用6%或7% 的分离胶，并适当延长电泳时间。

对于小于20 kDa的小分子蛋白或多肽，常规的Tris-甘氨酸系统分离效果可能不佳。这时，Tris-Tricine缓冲系统的预制胶（例如16.5% 的浓度）是更好的选择，它能更有效地分离2-40 kDa的小分子量蛋白。

2）使用梯度胶应对宽范围或不同大小的蛋白
如果需要分离的蛋白分子量分布很广，或者想在同一块胶上同时分析多个不同大小的蛋白，梯度胶（例如4-12% , 4-20% ）会非常方便。它从胶顶到胶底的浓度是连续变化的，因此可以在同一块胶上清晰地分离出分子量差异很大的蛋白。

三、经验

由于我的研究课题涉及到的蛋白分子量在15-150kd范围内，所以我常用的就是雅酶10%的一步法预混胶，下面给大家看看电泳的效果吧

⭐⭐这是刚开始跑的时候

⭐⭐ 这是快要结束的时候

、

四、我们WB时需要关注浓度胶的那些情况呢？

1.根据自己的目标分子选择对应的浓度胶，保证蛋白电泳过程中顺利下沉及分开，不懂时可以咨询一下师兄师姐，特别是与他人蛋白kd数差距甚远时。

2.配胶时一定要注意添加手法，学姐一直推荐左右滑动着加上下层胶，因为在玻璃板的一角加入，容易导致配胶浓度不均，即使添加前已吹打混匀，添加完毕+插完梳子以后，将制胶架于实验桌上轻磕一下，保证分界线平齐。

3.配胶后凝固时间适当，学姐真的不建议提前配胶，尽量现配现用，学姐之前在北方，夏天冬天温差不是特别大（因为北方有暖气），所以我夏天和冬天的凝胶时间都是固定的。但是学姐现在到南方了，冬天的时候气温低，凝胶时间就需要延长20-30min，或者多添加一些促凝剂，以便缩短凝胶时间。

判断浓度胶凝固知识点：插梳子以后，玻璃板会多出一部分上层胶流在制胶架上，我们可以等待20-30min以后，将玻璃板拆卸下来，看看多余的胶是否凝好，若是呈胶条状，则代表胶已凝好，可以电泳。

4.注意缓冲液系统,分离小分子量蛋白（<20 kDa）时，记得Tris-Tricine系统比常规的Tris-甘氨酸系统效果更好。

5.预制胶是很多同学的优先选择，因为可以节省配胶时间，但是一定要注意预制胶的保存以及使用方法，否则可能会让你浪费更多的时间去试错。对于大分子量蛋白，有建议使用6%的分离胶，而小分子量蛋白则可选用16.5%的Tricine预制胶，常规分子量推荐10%的预制胶。

文源【医学盛夏学姐】

普拉特泽，坚持提供真实、完整、唯一原始数据、原始图片。

普拉特泽生物，自有专业动物房、造模实验室，配套设备齐全，技术团队成熟，熟练掌握各类动物模型构建，更有细胞、分子、病理平台，一站式解决后续相关实验检测。请点击分子实验平台了解详情

大家一起学习吧！！18570028002（微信同号）