利用荧光标记的二级抗体（即二抗）与目标抗原结合，从而实现对特定蛋白质的检测。普拉特泽生物承接等病理染色相关服务上万例，积累了操作大量经验，为大家详细分享免疫荧光实验方法，同时为广大科研工作者开展线上的理论培训与线下实操，可承接免疫荧光实验外包服务

一、免疫荧光二抗法VS TSA法

二抗法

荧光二抗法是利用荧光标记的二级抗体(即二抗)与目标抗原结合，从而实现对特定蛋白质的检测。操作相对简单，适用于多种样本和抗体，缺点是信号强度可能受一抗和二抗结合效率的影响，对低丰度抗原信号较弱。

TSA法

TSA法是一种信号放大技术，其主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基)结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。同时也适用于相同来源一抗的双重荧光免疫标记。

                                                                                                            二、TSA实验流程
1、石蜡切片脱蜡至水:依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液l10min-环保型脱蜡液I10min-环保型脱蜡液I 10min-无水乙醇15min-无水乙醇115min-无水乙醇I 5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复:组织切片置于盛满抗原修复缓冲液的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(这里是以微波加热法抗原修复方式为例，具体修复方式需根据组织类型及抗体种类选择对应的抗原修复液及修复方式)

3、双氧水封闭:切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈(防止试剂流走)，切片平放于避光湿盒滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

5、加一抗:轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。
6、加对应种属HRP标记二抗:将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
7.加iF488-TSA工作液:将玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF488-TSA工作液，避光室温孵育10 min。孵育完后玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5 min

8.抗体洗脱

8.1微波处理:组织切片置于盛满抗原修复液(根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液)的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。(加热的温度和时间建议:加热到95℃以上，维持15分钟。)此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
8.2洗脱处理:切片稍甩干后将恢复至室温的抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
9.血清封闭:切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30 min，具体根据第二种一抗及对应的二抗种属决定封闭试剂。

10.加第二种一抗:在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒底部加少量水防止抗体蒸发)。

11.加对应的HRP标记的二抗:玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min.

12.加iF555-TSA:玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加配制好的iF555-TSA工作液，避光室温孵育10 min。孵育完后，玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
13.DAPI复染细胞核:切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。14.自发荧光淬灭:玻片置于PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入组织自发荧光淬灭剂避光孵育5 min，流水冲洗10 min。15.封片:切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

16.镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像，也可用荧光扫描仪扫描成像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。

三、TSA法实验注意事项

1.与二抗相比，TSA 试剂具有更高的灵敏度和更强的信号放大效果。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。

2.如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。

3.荧光Tyramide的建议稀释比是1:500,0检验结果调整稀释比例(调整范围1:1000)。

4.为保证抗体洗脱效果及荧光多重标记效果，正式多重标记之前需分别做各个抗体的TSA单标测试(即一抗-HRP二抗一对应多中的TSA)，确定每个抗体单标都能做出较理想的阳性后再根据单标测试结果去确定多标的抗原修复条件，抗体顺序等实验条件
5.如果有些抗体效价高，亲和力较强，不洗脱彻底，可提高洗涤温度至50℃ 30 min或增加洗脱次数，即组织上加入抗体洗脱液37℃孵育 30 min后，去掉抗体洗脱液，再入新的抗体洗脱液，继续 37℃孵育 30 min6.抗体洗脱液流动性强，片子未水平放置时，试剂易流出圈外，影响洗脱效果，需在操作过程注意切片平放。

6..操时需带手套，口罩，穿实验服，避免话剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触到敏感区域，立即用大量清水冲洗。

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