Question：免疫荧光操作指南有哪些？（普拉特泽生物提供长期稳定的组织染色外包服务）

   答：免疫荧光实验 Protocol

免疫荧光实验的每一步都至关重要，任何一个环节出错都可能导致实验失败。下面详细介绍免疫荧光实验的步骤，帮助大家掌握实验要点。
（一）样品准备：细胞状态是关键 样品准备是免疫荧光实验的第一步，也是关键一步。细胞状态直接影响实验结果，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，都需要正确处理。 1. 贴壁细胞：爬片操作要点  新手建议直接购买商品化的无菌爬片。放置爬片时，要注意爬片直径要小于孔板，避免后续操作中出现麻烦。接种细胞后，小心取出爬片，倒扣在盖玻片上，操作时要小心，避免细胞脱落。 2. 悬浮细胞：预处理让细胞贴壁  爬片需提前几小时用多聚赖氨酸或细胞黏附剂处理，以便悬浮细胞能够贴壁。处理后接种细胞，后续步骤与贴壁细胞一致。这一步需要耐心，不能急于求成。 

 （二）固定：选对试剂，防止抗原位移 固定是为了让细胞内的抗原保持稳定，不发生位移和降解。通常使用 4% 多聚甲醛室温固定 15 分钟，然后用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 分钟。但如果是检测磷酸化抗体，不能使用甲醛，而应选择冰冷的无水甲醇或乙醇，否则磷酸蛋白会移位，导致实验失败。 

 （三）通透：让抗体进入细胞内部 通透的目的是让抗体能够顺利进入细胞内部与目标抗原结合。使用 0.5% Triton X-100 室温通透 20 分钟即可。但如果目标抗原在细胞膜上，这一步可以省略，以免破坏细胞结构。 

 （四）封闭：防止非特异性结合 封闭是为了防止一抗和二抗与细胞内的非特异性位点结合，从而避免高背景噪音。通透后用 PBS 洗 3 次，吸干液体后，滴加 5% BSA（用 TBST 稀释）或同来源血清，室温封闭 1 小时。从这一步开始，要保持样品湿润，避免干燥导致背景信号过高。 

 （五）抗体孵育：浓度和时间是关键 抗体孵育是免疫荧光实验的核心步骤，一抗和二抗的孵育条件直接影响实验结果的准确性。 1. 一抗：4℃过夜更精准  按说明书稀释一抗，吸尽封闭液后滴加，放入湿盒 4℃孵育过夜。回收一抗后，用 PBST 洗 3 次，每次 5 分钟，摇床慢摇，去除非特异性结合的抗体。 2. 二抗：避光操作防淬灭  滴加稀释好的荧光二抗，室温孵育 1 小时，同样用 PBST 洗 3 次。从加二抗开始，所有操作都要在暗处进行，避免荧光淬灭。 

 （六）复染核与封片：细节决定成像质量 最后一步是复染核与封片，虽然看似简单，但也很重要。使用 DAPI 避光孵育 5 分钟，用 PBST 洗去多余染料，然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。封片时要小心避免气泡，否则显微镜下会出现“马赛克”，导致实验失败。 

 避坑 Tips：搞定串色，实验结果更清晰 免疫荧光实验里，串色问题特别烦人，一不小心就毁了实验结果。下面这些小技巧，帮你轻松应对串色，让实验结果更干净。 （一）细胞处理：密度和状态很重要 1. 铺细胞别太密！

1. 铺细胞别太密！

用状态好、没被污染的细胞做实验，这是必须的。要是细胞被支原体污染了，那可就麻烦了，会出现各种奇怪的染色问题，核和抗体都会被染得乱七八糟，怎么洗都洗不掉。所以，实验前一定要检测支原体，别让这些小东西毁了你的实验。

（二）染色顺序：核染放最后，浓度别太高

双抗体染色的时候，别一开始就用Hoechst染核，这是个常见的错误。正确的做法是把核染放到最后封片的时候，而且要用低浓度的DAPI。核很容易着色，高浓度的染料会让核的荧光太强，不仅会抢了其他信号的风头，还可能导致荧光串色。记住，低调核染，信号才会更纯净。

（三）抗体选择：种属和浓度是关键

1. 一抗：种属不同，避免“撞车”

双抗体染色时，一抗的种属选择很重要。一定要用不同种属的一抗，比如鼠和兔，这是经典组合，效果很好。要是用双鼠或双兔的一抗，二抗很容易交叉结合，结果就是串色。另外，如果是外转质粒，可以选择标签抗体，特异性高，浓度1:500左右就行；如果是内源性蛋白，1:200就足够了，别盲目追求高浓度，有时候过犹不及。

2. 二抗：室温孵育，洗得更干净

二抗孵育时，常温1-2小时就行，记得全程避光。洗涤也很重要，二抗用TBST（可以多加些吐温），能更好地洗掉非特异性结合的抗体；一抗用PBS就行。不同荧光标记的二抗，要选波长差异大的，比如绿光488、红光555，这样能减少光谱重叠，降低串色风险。

（四）拍摄技巧：波长和参数调对了吗？

封片后的拍摄环节也不能马虎。适当缩短激发光波长，能有效避免交叉波长干扰。用显微镜拍摄时，每个通道单独设置滤光片，逐个扫描，别同时采集，这样能大大减少串色。别偷懒不调参数，一张好图胜过千言万语，精心调整参数才能拍出满意的照片。

常见问题：这些坑你踩过吗？

（一）背景信号高？

免疫荧光实验里，背景信号过高是让人特别烦的问题。本来应该清晰的图像，结果被一层乱七八糟的背景信号给盖住了。这多半是因为实验里一些小细节没注意好。比如封闭没做好，封闭液和二抗不是同来源的，这就相当于给细胞穿了件不合身的衣服，挡不住非特异性结合；还有洗涤不彻底，洗涤次数不够，摇床速度太慢，多余的抗体和杂质就留在细胞上，背景信号肯定就上去了。所以说，实验里的每一步都得认真，不能马虎。

（二）信号弱或无信号？

要是实验结果信号弱或者干脆没信号，那可真是让人着急。这时候得好好回想一下实验过程。一抗是不是失效了？抗体是实验的关键，要是它失活了，肯定没法和抗原结合，也就没信号了。再看看一抗浓度是不是太低，孵育时间够不够？特别是4℃过夜孵育，温度和时间都得达标，不然一抗和抗原结合不充分，信号自然就弱或者没了。所以在实验前，一定要仔细看抗体说明书，按要求操作，别凭感觉瞎搞。

（三）串色严重？

串色问题在免疫荧光实验里特别麻烦，不同的荧光信号搅和在一起，实验结果乱七八糟。要解决串色，就得回头看看前面说的那些避坑 Tips。检查一下细胞密度是不是合适，细胞太密容易增加非特异性染色和串色风险；看看抗体种属是不是选对了，一抗种属搭配不当，二抗就会交叉结合；荧光染料波长是不是合理，波长相近的染料容易光谱重叠；拍摄参数对不对，参数不对会让串色更严重。免疫荧光实验就像一场需要精准配合的舞蹈，从样品准备到拍摄成像，每一步都得踩准点，不然就会串色。只要每一步都优化好，实验结果肯定能干净漂亮。

免疫荧光实验从样品准备到拍摄成像，每一步都有挑战，也都有技巧。记住了这些 Protocol 和避坑 Tips，就能避开串色的坑，让实验结果清晰又漂亮，以后发文章再也不用为图发愁了！

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