原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为insitu hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position."字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。那么今天的文章呢，小编就带大家来详细了解下原位杂交。

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实验原理

用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。

基本原理--碱基互补配对原理

探针的分类

1. cDNA(complementary DNA)——互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）：

  优点：1. 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽；2. 较不易被降解；3. 标记方法可靠易行。

2. RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）：

  优点：1.杂交效率比DNA探针高；2.在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定。

  缺点：容易受RNA酶的污染而被降解

3. 寡核苷酸， 短链探针(长度10-50个核苷酸)：根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成。

  优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)；

  缺点：特异性较低（短链和简单）。

核酸探针标记物

1、放射性标记物--3H、32P、35S、125I等

    特点：敏感性高，但半衰期短，有放射性污染，成本高

2、非放射性标记物--生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等

    特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时短，标记探针可较长时间的保存和使用

3、地高辛标记探针的显色检测

    地高辛（Digoxigenin 简写Dig-）：类固醇半抗原分子，人及多种动物体内不存在类似的物质，无交叉反应。

    特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似，较放射性标记系统安全，方便、省时间，定位准确，杂交背景好。

实验步骤

器材的特殊处理

DNA-FISH：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA原位杂交。

RNA-FISH：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防 。

去除或抑制RNA酶方法

1. 物理方法：

(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒

(2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶

(3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上

(4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理

(5)整个操作过程带手套和口罩。

2. 化学方法：

(1)焦碳酸二乙酯( DEPC )

(2)RNA酶抑制剂（有毒）

取材

目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。

步骤：基本与免疫组织化学技术相似，即组织要求新鲜和迅速投入固定液。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制处理的器具接触标本。冷冻切片以厚5~30um最佳，40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱，在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久。

对照实验设置的意义

目的：保障实验结果的准确性和特异性

标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照

阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性；

阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性；

对照实验设置愈多，实验结果的可靠性就愈大。

注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照。

常用对照组的设置

(1)标本对照：选用已知为阳性或阴性的组织

(2)空白实验: 无探针的杂交液进行杂交

(3)选用其他生物学方法进行对照实验：提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern印记杂交、qPCR、RT-PCR

(4)RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应

(5)选用标记的非特异性（载体）序列或不相关的核酸探针进行杂交。

(6)探针孵育后的检测系统对照

注意事项

由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

实验结果可能的问题和原因

1.标本形态结构不佳

  a. 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解；

  b. 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致；

  c. 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮或脱片。

2.杂交信号弱

 a. 探针链太长不易深入细胞（50－100个碱基最佳）；

 b. 探针的标记不好；

 c. 靶序列暴露程度不佳；

 d. 探针和（或）靶序列的变性条件欠佳。

3.无杂交信号

 a. 标本内无靶序列的存在；

 b. 标本内存在靶序列，因实验某个环节的失误导致后者可能降解。

4.非特异性着色

 a. 探针特异性；

 b. 组织细胞内的内源性酶；

 c. 组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非特异性结合。

原位杂交的应用

①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；

②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；

③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；④基因在染色体上的定位；

⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；

⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

案例展示

好了，关于原位杂交的介绍就先告一段落了，如有实验相关需要可点击下方了解更多哦~